188700. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-dezoxinojirimicin N-szubsztituált-származékainak az előállítására
1 188700 2 Az oxidációt nemcsak növekvő mikroorganizmus—tenyészetekkel vagy ezekből nyert tömény sejtszuszpenziókkal, hanem az ezekből a baktériumokból előállított extraktumokkal vagy frakcionált extraktumokkal is lefolytathatjuk, amelyeket például a mikroorganizmussejteknek hagyományos módon történő feltárásával nyerünk. A feltárási módszer lehet például ultrahangos kezelés, French -nyomócellán való átvezetés, kvarchomokkal történő szétdörzsölés, lebontó enzimekkel történő inkubálás, autolízis vagy többszöri befagyasztás és felolvasztás. Ha az oxidációhoz nemfrakcionált nyers extraktumokat alkalmazunk, akkor elvileg ugyanazok a reakciókörülmények alkalmazhatók, mint amelyeket a növekedő vagy nyugvó mikroorganizmussejtekkel lefolytatott oxidáció esetén megadtunk. Ha az oxidációt részben tisztított extraktum-készítményekkel (enzimekkel) folytatjuk le, a készítmények előállításához a proteinkémia ismert módszereit — mint ultracentrifugálást, kicsapási reakciót, ioncserés vagy adszorpciós kroinatográfiát, gélszú'rést vagy elektroforetikus módszereket — alkalmazhatjuk. Annak eldöntésére, hogy a megadott módszerek melyikével előállított frakció alkalmas a találmány szerinti oxidációs reakció lefolytatására, a frakció alikvot részét 20—45°C hőmérsékleten 2—10 pH—érték mellett összekeverjük az oxidálandó vegyülettel és vékonyréíegkromatográfiásan vizsgáljuk a kívánt termék keletkezését. Amennyiben a reakciót frakcionált sejtextraktumokkal végezzük, szükséges lehet, hogy a reakcióelegyhez további komponenseket, - például fiziológiai vagy mesterséges clcktronakceptorokat —mint NAD+—t, NADP+-t, metiléükékct, diklór—fenol-indofenolt, tetrazoliumsólcat — adagoljunk. Iía ilyen komponenseket kell adagolnunk, akkor ezeket anyagnyi mennyiségben — azaz az oxidálandó vegyületnck megfelelő koncentrációban — vagy katalitikus mennyiségben — azaz az oxidálandó vegyület koncentrációjánál lényegesen kisebb koncentrációban — adagoljuk. Ha a második esetben az oxidációnak közel kvantitatív lefolyását akarjuk biztosítani, akkor a reakcióelegyhez olyan rendszert is adunk, amely csak katalitikus mennyiségben bevitt reakciókomponcnseket állandóan regenerálja. Ez lebet például valamilyen enzim , amely az oxidációs folyamat alalt redukálódott elektronakceptort oxigén vagy más oxidálószer jelenlétében reoxidálja. A frakcionált sejtextraktumokkal végrehajtott oxidációra egyébként ugyanazok a teltételek kedvezőek, amelyeket a növekedő rnikrorganizmus—tenyészetekkel vagy tömény scjtszuszpenziókkal végzett oxidációnál már megadtunk. Itt is 20^15oC közötti hőmérsékletet és 2—10 közötti pH—értéket alkalmazunk. A képződött reakciótermék maximumát azonban rövidebb idő alatt érjük el. Az extraktum koncentrációjától függően 2 óra és 3 nap közötti inkubációs idő elegendő. A kívánt vegyületnck a táptalajban való képződését az idő függvényében vékonyréíegkromatográfiásan követhetjük. A (XII) általános képletíí vegyiiletcket — a (XII) általános képletben R és Y jelentése a már megadott — ismert módon például a 12 278.számú európai szabadalmi bejelentésben leírt módon izoláljuk. Különösen előnyösen a (XII) általános képletíí vcgyüleícket — a (XII) általános képletben R és Y jelentése a már megadott — közvetlenül az oxidáló elegyböl kristályosítjuk, elválasztjuk és valamilyen megfelelő oldószerből, például valamilyen alkoholból - mint metanolból — átkristályosítjuk. A védőcsoport lehasításához a megfelelően blokkod (XII) általános képletű 6—amino—szorbóz—származékot - a (XII) altalános képletben R és Y jelentése a már megadott — szobahőmérsékleten tömény vagy híg savban -például sósavban- keverjük és a védőcsoport lehasadását vékonyréíegkromatográfiásan követjük. Vízzel elegyedő szerves oldószer például n—propanol adagolása után a deblokkolt (VII) általános képletíí 6—amino-szorbóz—származékot — a (VII) általános képletben R jelentése a már megadott — hidrokloridja alakjában kristályos formában vagy szirup formájában izoláljuk. A (VII) általános képiéin vegyület — (VII) általános képletben R jelentése a máé megadott — így kapott sóját ismert módon hidrogénezésscl (7040. számú európai szabadalmi bejelentés) az (I) általános képletű vegyülette - az (I) általános képletbe! R jelentése a már megadott -- alakítjuk. A hidrogénezést vizes oldatban szobahőmérsékleten H2 -túlnyomással (például 20 x 10s Pa) végezzük. Katalizátorként nemesfém--katalizátorokat (például 5%os Pt-szenet), előnyösen azonban Raney—nikkelt alkalmasunk. 1. példa 1 —tere—Butiloxi—karbonil—amino—szorbit előállítása. 90 g 1 — amiiio—szorbitot beviszünk 500 ml tetral idrofurán cs 500 ml víz elegyébe, majd szobahőmérsékleten hozzácsepegtetünk 500 ml tetrahidrofuránban oldott 131 g di- tere—butilexi—karbonil—pirokarbonátot. A rcakcióelcgyct 1 éjszakán keresztül keverjük, a te t fahidro furái it lcdesztilláljuk, a vizes fázist kétszer etil-acctáttal extraháljuk, ezt követően a vizes fázist szárazra pároljuk és a visszamaradó anyagot izopropanoból átkristályosítjuk. Kitermelés: 110 g, olvadáspont: 86—88°C. 2. példa I —tere—Butil oxi — ka rbonil —ami no—N —szorbit előállítása. Az 1. példában leírtakkal azonos módon dolgozunk, kiindulási anyagként l-rnetil-amino-szorbitot alkalmazunk. Kitermelés: 95%, olvadáspont: 78—80°C. 3. példa 1—tere-Butiloxi-karbonil—amino—N—(0— hidroxi—etil)—szórbit előállítása. Az 1. példában leírtakkal azonos módon dolgozunk, kiindulási anyagként 1 -ß- hidroxietil—amino— —szorbitot alkalmazunk. Kitermelés: 78%, olvadáspont: 103-104°C. 4. példa Az 1 -terc-Butiloxi-karbonil-amino-szorbit óxdálása Gluconobacter oxidans ssp. suboxidans—sál (DSM50 049). A reakciót a következő összetételű tápoldatban folytatjuk le: 20 g/1 élesztőkivonat 50 g/1 szorbit 4 g/1 kálium—dihidrogén—foszfát. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
