188684. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponenesének valanint a vele egyszerre keletkező A1 és A2 komponensek előállítására
188 684 2 1 XIII. Táblázat (folytatás) Eluáló rendszerek {v/v/v) I R f értékek 4. klorofonn:ctanol:10%-os ecetsav 4:7:2 arányú elegye 5. n-butanol:ecetsav:viz 4:1:5 arányú elegye 6. mctanol:10%-os vizes ammóniunr-acetát:10%-os ammónium-hidroxid 10:9:1 arányú elegye 7. n-butanol:piridin:víz:ecetsav 6:4:3:1 arányú elegye 8. metanol:10%-os vizes ammónium-acetát:10%-os ammónium-lridroxid 10:9:1 arányú elegye 9. 0,25 mól vizes nátrium-dihidrogén-foszfát:acctonitril 1:1 arányú elegye 10. metanol:!0%-os ammonium-acetát 1:1 arányú elegye 11. n-butanol:ecetsav:víz 4:2:5 arányú elegye 0,00 5 0,17 0,52 10 0,45 0,11 0,68 0,65 0,77' 15 20 Rm: körülbelül 140 mm Mennyiségek: 2—5 pl oldat (1 mg/nü), az anyagot acetonitril-víz 25 1:1 térfogatarányú elegyében oldva. Előhívás: a) B. subtilis ATCC 6633; sz. mikroorganizmussal beoltott agar-lemezeken bioautografálva; b) a-naftol-szulfonsavval elszenesítve hevítés hatására; 30 c) jódgőz; d) klór-toluidin reagens; e) 254 mii hullámhosszúságú ultraibolya fény. 1—7 szilikagél 60 F254 lemezek (Merck); előhívás: a,b,c, d,e 35 8, 9 szilikagél 60 F254 szilanizált (Merck);előhívás:e. 10, 11 — cellulóz F lemezek (Merck); előhívás: a, e. A 3. példában leírtak szerint izolált és tisztított A/16686 jelű antibiotikum komplex nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízise kimutatta, hogy három komponens 40 van jelen, melyeket A, A2 és A3-nak neveztünk, ezek közül a fő komponens az A2 körülbelül 70—80%-a a komplexnek. Részletesebben, a nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízis eredményei, valamint a végrehajtás körülményei a következő táblázatban szerepelnek (to-45 luol, a-nitro-naftalin és antracén volt a belső standard): XIV. Táblázat Csúcs száma 3 4 *R 50 Aj á2 A3 toluol a-nitro-naftalin antracén 3 nerc 84/100 másodperc 4 perc 99/100 másodperc 6 perc 84/100 másodperc 8 perc 64/100 másodperc 55 11 perc 14/100 másodperc 35 perc 18/100 másodperc Oszlop: p-BondapackRCig (3,9 mm belső átmérő x 300 mm) 60 Mozgó fázis: 0,025 mól ammónium-formiát:acetonitril 60:40 terfogatarányban, Áramlás: 2 ml/perc. Nyomás: 2000 psi. Delektor: ultraibolya 254 nm. 65 4. példa A 3. példában leírtak szerint nyert A/16686 jelű komplexből 169 mg-ot oldunk 0,01 n sósavban (6,5 ml) és desztillált vízben (10,4 ml). Reverz fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával [oszlop: p-BondapackR C is (7,8 mm belső átmérő x 300 mm), áramlás: 4 ml/perc — nyomás: 2000 psi — mozgó fázis: 0,025 mól ammónium-formiát:acetonitril 65:35 térfogatarányú elegye] és 1 vagy 2 ml fenti oldat ismételt beinjekciózásával az egyes faktorokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és tovább vizsgáljuk analitikai nagynyomású folyadékkromatográffal. A frakciókat csökkentett nyomáson, alacsonyabb mint 35 °C hőmérsékleten besűrítjük butanol hozzáadása mellett, hogy elkerüljük a hab-képződést. A kapott maradék oldatot liofilizáljuk, és a kapott szilárd anyagot külön feloldjuk desztillált vízben, és ismét lie filézzük; így kapunk 10 mg A/16686 jelű antibiotikum A, komponenest, 95 mg A2 komponenst és A3 (12 mg) komponenst. A fentiekben kapott A/16686 A- komponensének sósavas oldatát liofilezve, a megfelelő hidrokloridot kapjuk, amorf, fehér por formájában, mely 250 °C hőmérsékletnél bomlik. 5. példa Az A/16686 jelű antibiotikum komplex (100 mg), melyet a 3. példa szerint kapunk (titer: körülbelül 40%), 0,1 n sósavban oldunk (15 ml). A kapott oldatot AmbcrliteRXAD-2 oszlopra visszük fel (136 ml, az ágy magassága: 60 cm), előzetesen mossuk acetonitrillel és desztillált vízzel. Az oszlopot 0—34%-ig változó összetételű acctonitril-víz térfogat-elegyű oldattal fejlesztjük ki, és 250 10 ml-cs frakciót gyűjtünk. Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponenset tartalmazó 185-225. frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk 35 °C hőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten, butanol hozzáadása mellett, hogy csökkentsük a habképződést. A maradék oldatot liofilezve 6,7 mg A/16686 jelű antibiotikum A2 komponenst kapunk. 6. példa A 3. példában leírt módon kapott 10Ö mg A/16686 jelű antibiotikum komplexet (íiter: 53,5%) 10 ml acélomtól 0,25 mól vizes anunónium-formiát 27:73 térfogat irányú elegyében oldunk. A kapott oldatot AmberlitcRXAD-2 oldatra visszük fel (200 ml — az ágy magassága: 52 cm), előzetesen 0,25 mól ammónium-fo/miáttul éa acetonitril-0,25 mól ammőnium-formiát 27:73 térfogatarányű elegyével mossuk. Az oszlopot acc tonitiii-25 mól anunónium-formiát 27-40%-os lineáris gradiensű elegyével fejlesztjük ki, 400 ml-ig 10 ml-es frakciókat gyűjtve, majd az clutSószer 2 1-es térfogatáig 6 ml-es frakciókat gyűjtve. A leoldolt frakciókat analitikai nagynyomású folyadék-kromatográfiai vizsgáljuk, és a komponens-összetételre a következő eredményeket kapjuk: Frakciók A/16686 A1 komponens 7, A/16686 A1 komponens % A/16686 A 3 komponens % 31-41 90,1 9,9 0 42-50 53,9 46,1 0 51-59 17,9 82,1 0 60-65 4,4 • 93,7 1,9 10
