188684. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponenesének valanint a vele egyszerre keletkező A1 és A2 komponensek előállítására
1 188 684 2 Az A/16686 antibiotikumokra érzékenynek ismert organizmusokat lehet használni erre a célra. Egy különösen jól használható vizsgáló organizmus a Sarcina lutea ATCC 9341. A biológiai vizsgálatot kényelmesen végrehajthatjuk az agar-diffúziós módszerrel, agar lemezeken. A maximális antibiotikus aktivitás általában a harmadik és ötödik nap között jelenik meg. Az Actinoplanes ATCC 33076 fajhoz tartozó törzs által termelt antibiotikumok a fermentáció során főleg a micéiium-tömegben találhatók. Az A/16686 antibiotikumok kinyerésére előnyösen szolgáló módszer ebből következően az elválasztott micélium extrakciója. A miccliuni-tömeg extrakcióját legjobban metanollal lehet elvégezni, de más, alacsony szénatomszámú alkanolok és aceton is alkalmas erre a célra. Az A/16686 antibiotikumokat az extraháló oldószerből rutin eljárással kinyerhetjük, és így kapjuk az A/16686 antibiotikumok keverékét, az A/16686 komplexet. Az A/16686 komplexet tovább tisztítjuk, majd az egyes külön komponenseket elválasztjuk egymástól. Az A/16686.komplex egyes komponensekre történő elválasztását az ismertetett módszerek igen sok fajtájával érhetjük el, melyek lényegében kromatográfiás eljárásokat foglalnak magukban. A faktorok optimális elválasztásához reverz fázisú 11PLC használható előnyösen. Az ilyen HPLC-elválasztás során az előnyösen használható oszlop a p-BondapackRCis, valamint az előnyösen használható mozgó fázisok az ammónium-formiát és acetonitril vizes keverékéből áll, különböző arányokban. Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponensének nagy mennyiségben történő elválasztására oszlop-kromatográfiát használhatunk előnyösen. Az ilyen oszlopelválasztás során előnyösen használható adszorbcálószer az AmberlitcR XAD, valamint az. előnyösen használható oldószer-rendszerek víz és acetonitril, valamint víz és ammónium-formiát, valamint acetonitril keverékéből állnak. Az Ai és A3 minor komponensek oszlop-kromatográfiával történő elválasztását végrehajthatjuk; de ez a feldúsított frakciók további oszlopon történő elválasztását kívánja, ismét az. Amberlite XADR az előnyösen használható adszorbcálószer, valamint a víz és acetonitril, és víz és, ammónium-formiát és acetonitril keverékek az előnyösen használható oldószer-rendszerek. Az A/l6686 antibiotikum A2 komponensének jellemzése Az A/16686 komplex A2 komponense fehér, amorf por, mely bomlás közben körülbelül 210—220 °C hőmérsékleten olvad. Az A/16686 jelű komplex A2 komponense oldódik vízben, dimetil-formamidban, vizes metanolban, 0,1 n sósavban; gyengén oldódik abszolút etanoiban és nbutanolban; kicsapódik a vizes oldatból telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat hozzáadásával. . Az. A/16686 antibiotikum A2 komponensének elemanalízise előzetesen 140 °C-on, inert atmoszférában számított mintából a következő — közelítő — %-os összetételt mutatja: (átlag) szén: 54,57 %; hidrogén: 6,19 %;• nitrogén: 10,88 %. A klór-analízis a következő %-os értéket adja: klór: 1,37 %. Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponensériek infravörös spektruma nujolban a mellékletben szereplő 4 1. ábrán látható. A következő abszorpciós maximumokat figyelték meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1240, 1175, 1130, 1060, 1015,975,840 és 815 cm"1. Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponensének ultraibolya abszorpciós spektruma a mellékletben szereplő 2. ábrán található, és a következő abszorpciós maximumokkal rendelkezik: a) 234 nm (E1,^ = 2Ö6) 268 ntn (E1,^ = 114) b) 0,1 n sósavat tartalmazó metanol 233 nm (EV^n = 192) ' 271 nm (E1^ = 93) c) 0,1 n nátrium-hidroxidot tartalmazó metanolban 251 nm (E1,^, = 275) = 300 nm (vall). Az A/16686 antibiotikum A2 komponense a következő jeleket adja 270 MHz-es proton mágneses magrezonancia spektrumban, melyet a 3. ábrán láthatunk, és dimetil-formamid/d7/D20 1:1 (v/v) oldatban rögzítettük (TMS a belső standard, delta = 0,00 ppm), Pulse Fourier Transform Bruker WH 270 krio-spektrométeren: (i) Egy jelcsoport 0,5—3 ppm-nél megfelel körülbelül 51 alifás protonnak, az egyes konkrét dublcttek központja körülbelül 1,53 ppm-nél (J = 7 Hz), 1,20 ppm (J = 6 Hz) és 1,07 -ppm (J = 5 Hz). (ii) Egy jelcsoport 3—6,5 ppm-nél, mely megfelel körülbelül 43 olefin-típusú protonnak, vagy heteroatomhoz kapcsolódó, szénatomon levő protonnak, konkrétan egy szingulettnek, körülbelül 5,62 ppm-nél. (iii) Egy jelcsoport 6,5-8 ppm-nél, mely megfelel körülbelül 39 aromás protonnak, konkrétan dublettek, melyek körülbelül 7,6 ppm-nél helyezkednek el (J = 8 Hz), 7,49 ppm-nél (J = 9 Hz), valamint 6,46 ppm-nél (J - 8 11/). ■ A 8, 2,85 és 3,05 ppm-nél megjelenő szingulettek, valamint a 4,73 ppm-nél megjelenő szingulett megfelel a dimetil-förmamidnak, valamint a HDO-nak az oldószer-keverékben. Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponensének specifikus forgatóképessége [cr]23 = +72 ±4° (c = 0,49, víz). Az A/16686 jelű antibiotikum A2 komponensének különböző papír-kromatográfiás rendszerekben kapott Rf-értékcit Bacillus subtilis ATCC 6633 organizmust használva előhívásra, a következő, IV. táblázatban láthatjuk: IV. Táblázat Az A/16686 jelű antibiotikum A 2 komponensének kromatográfiás tulajdonsága (Whatman 1-es számú papír)* Eluáló rendszer Rç-értëk n-butanoí 6,0 pH-jú Sörensen-pufferral telítve 0,00 2% p-toluol-szulfonsavat tartalmazó, vízzel telített n-butanol 0.00 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
