188618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-analógok előállítására
1 188 618 2 juk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és a terméket elkülönítjük. Ily módon 2,0 g (hozam: 92 %) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]pS = + 2,79° (c = 0,5, metanol). ej lépés L-(N-Metil)-tirozil-D-(0-metil)-szeril-glicin[N-etil-N-(l-benzii-2-dimetil-amino)-etil]-amid-diacctát 20 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 2,0 g (4,3 millimól), a fenti b) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd a terméket 400 ml dietil-éter hozzáadásával kicsapjuk. Az oldatot leöntjük és a maradék olajat dietil-éterrel többször eldörzsöljük, az oldószert minden esetben leöntjük. Az így kapott olajat ezután feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, és az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0- ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon olajos terméket kapunk. 15 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 1,31 g (2,75 millimól) Nalfa-tercier-butoxi-karbonil-Na'fa-metii- L-tirozin-diciklohexil-amin-sót, az oldatot -15 °C hőmérsékletre hűtjük és keverés közben, gyorsan hozzáadunk 3 csepp N-metil-morfolint és 0,36 ml (2,75 millimól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten keverjük, és eközben az előző bekezdésben leírt módon előállított dipeptid szabad bázis formáját feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, az oldatot —15 °C hőmérsékletre hűtjük és hozzáadjuk a fent leírt módon előállított vegyes anhidridhez. A reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Utána a szilárd részeket kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, és az elegy pH-ját 2 normál nátriumhidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon 1,9 g (hozam: az elméletinek 107 %-a) olajos terméket kapunk. Ezt az olajat feloldjuk 20 ml trifluorecetsav és 3 ml anizol elegyében és az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékként kapott olajhoz dietil-étert adunk, és az így kapott szilárd anyagot kiszűrjük és megszárítjuk. Ezt a szilárd anyagot puffer-oldatíal (18% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mólos ammónium-acetát-oldat, pH = 4,2) 9,0 ml össztérfogatra oldjuk. Az oldatot felvisszük egy 4 X 70 cm méretű, C18 fordított fázisú szilikagéllel töltött, a fenti puffen oldattal egyensúlyba hozott oszlopra. Az elutumot 280 nrn hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott, fehér színű, szilárd anyagot feloldjuk 6 ml 50 %-os ecetsavban, és az oldatot felvisszük egy 2,5 X X 90 cm méretű G-10 Sephadex oszlopra. Az oszlopot 50 %-os ecetsawal eluáljuk, és az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 1,35 g ■hozam: 74 %) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]p = + 36,0° (c = 0,5,1 mólos ecetsav). Analízis aC33H51N509 képlet alapján (mólsúly: 661,8): számított: C 59,89; H 7,77; N 10,58; talált: C 59,71; H7,71; N 10,57. Aminosav-analízis (/rmól/'mg): 1) 21-órás hidrolízis: Ser(Me), 0,251; Ser, 0,814*; Uly, 0,489. 2) 72-órás hidrolízis: Ser(Me), 0,031; Ser, 0,822*; Gly, 0,946. *Ser(Me) a savas hidrolízis során részben szerinné alakul. Térdeszorpciós tömegspektrum: molekulaion: 542. 4. példa L-(N-Metil)-tirozil-D-alanil-glicin[N-meti!-N-(l-benzil-2-dimetil-amino)-etil]amid-diacetát a) tépés Nalfa-tercier-Butoxi-karbonil-Nalfa-metil-L-fenil-alanin-dimetil-amid 150 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 9,21 g ;0,02 mól) Nalfa-tercier-butoxi-karboniI-Nalfa-metil-L- íenil-alanin-diciklohexil-amin-sót. Az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 1,63 g (0,02 mól) iimetil-amin-hidrokloridot. Az elegyet 2 percig 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 2,7 g (0,02 mól) 1-hidroxi-benzotriazolt és 4,13 g (0,02 mól) N,N’-dimklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 7 órán át 0 C hőmérsékleten, majd 19 órán át szobahőmérsékle■en keverjük. Ezután 0 C hőmérsékletre hütjük, az ol■latlan részeket kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat feloldjuk etil-acetátban, és az oldatot először 1 normál nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, majd lehűtött 1,5 normál citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk. Ezután a szerves részt vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 6,08 g (hozam: 99 %) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (fenil), 7,2; delta (CH3), 2,8; delta [N(CH3)2 ], 2,9. Analízis a C17H26N203 képlet alapján (mólsúly: 306,4): számított: C 66,64; H 8,55; N 9,14; talált: C 66,38; H8,28; N 8,88. Térdeszorpciós tömegspektrum: molekulaion: 307. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
