188618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-analógok előállítására
b) lépés 1 188 618 d) lépés 2 l-(N-tercier-Butoxi-karbonil)-metil-amino- 1 -benzil-2-dimetil-amino-etán 40 ml vízmentes piridin és 2,16 g (0,057 mól) nátriumbórhidrid elegyéliez hozzáadunk 5,86 g (0,019 mól), a fenti a) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet 48 órán át keverve forraljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékhoz lassan, 1 óra alatt 6 normál sósavat adunk. A kapott oldat pH-ját 1 normál sósavval 5.0- ra állítjuk, majd dietil-éterrel kirázzuk. A vizes részt elválasztjuk, pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10.0- ra állítjuk és etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos részt vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk kloroformban, és az oldatot felvisszük egy Water’s-féle szilikagél oszlopra. Az oszlopot egy System 500A jelzésű Water’s-féle preparatív folyadék-kromatográfban szakaszos gradiens elucióval (oldószer: kloroform -»■ tetrahidro-furán) eluáljuk. Az elutumot vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és a terméket elkülönítjük. Ily módon 2,5 g (hozam: 45 %) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (fenil), 7,2; delta (Boc), 1,4; delta [N-(CH3)2 ], 2,2. c) lépés Nalfa-tercier-Butoxi-karbonil-Nalía-mctil- L-tirozil-D-alanil-glicin[N-metil-N-( 1 -benzil-2-dimetil-amino)-etil ]amid 30 ml 1 normál ecetsavas sósav-oldat és 2 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 2,2 g (0,008 mól), a fenti b) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a terméket dietil-éter hozzáadásával kicsapjuk. A felülúszót leöntjük és a maradék olajat dietil-éterrel többször eldörzsöljük, az oldószert minden esetben leöntjük. Az így kapott olajat ezután feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, és az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat feloldjuk 30 ml dimetil-formamidban, az oldatot 0 C hőmérsékletre hűtjük, majd hozzáadunk 2,13 g (0,005 mól) Naifa-tercier-butoxi-karbonil-Nalfametil-L-tirozil-D-alanil-glicint, 0,68 g (0,005 mól) 1- hidroxi-benzotriazolt és 1,3 g (0,005 mól) N,N'-diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 19 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 °C hőmérsékletre hűtjük, a szilárd részeket kiszűrjük, és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, és az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnéziumszulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon olaj formájában 2,86 g (hozam: 95 %) cím szerinti vegyületet kapunk. L-(N-Metil)-tirozil-D-alanil-glicin[N-metil-N-(l-benzil-2-dimetil-amino)-etil]amid-diacetát 20 ml trifluor-ecetsav és 2 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 2,8 g (4,7 millimól), a fenti c) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajhoz dietil-étert adunk, és az így kapott szilárd anyagot kiszűrjük. Ezt a szilárd anyagot puffer-oldatban (9% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mólos ammóniumacet: t-oldat, pH = 4,2) 9,0 ml össztérfogatra oldjuk. Az oldatot felvisszük egy 4 X 70 cm méretű, Cis fordított fázisú szilikagéliel töltött, a fenti puffer-oldattal egyensúlyba hozott oszlopra. Az oszlopot a fenti pufferoldaital eluáljuk, és az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott, fehér színű, szilárd anyagot feloldjuk 5 ml 0,2 mólos ecetsavban, az oldatot felvisszük 2,5 X 90 cm méretű G-10 Sephadex oszlopra. Az oszlopot 0,2 mólos ecetsavval eluáljuk, és az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 411 mg (hozam: 14%) cím szer nti vegyületet kapunk. [a]j5 = + 64,8° (c = 0,5,1 mólos ecetsav). Analízis aC31H47N50« képlet alapján (mólsúly: 617,7): szál lított: C 60,27; H 7,67; N 11,34; tálát: C 60,12; H 7,67; NI 1,60. Am nosav-analízis: Alá, 1,05; Gly, 0,95. Térdcszorpciós tömegspektrum: molekulaion:498. 5. példa L-(N-Metil)-tirozil-D-alanil-glicin[N-etil-N-(l-benzil-2-dimetil-oxido-amino)-etil]amid-diacetát a) lépés Na^a-tercier-Butoxi-karbonil-Na*fa-etil-L-fenil-alanin-N,N-dimetil-amid 19,0 g (40 millimól) Nalfa-tercier-butoxi-karbonil- NaIfa-etil-L-fenil-alanin-diciklohexíl-amin-sót feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, az oldatot 0°C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 3,3 g (40 millimól) dimetil-amin-hidrokloridot. Az elegyet negyedórán át 0 °C hőmérsékleten, mágneses keverőn keverjük, majd hozzáadunk 5,4 g (40 millimól) 1-hidroxi-benzotriazolt és 8,3 g (40 millimól) N,N'-díciklohexil-karbodümidet. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután ismét 0 °C hőmérsékletre hűtjük és a szilárd részeket kiszűrjük. A szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékként kapott olajat feloldjuk etil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
