188487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Fusarium Moniliforme tenyészetéből az A3 jelű gibberelinsav mellett termelődött gibberellinek kinyerésére
1 188 487 2 A találmány tárgya eljárás Fusarium moniliforme tenyészetéből az A3 jelű gibberellinsav mellett termelődött gibberellinek kinyerésére. A gibberellinek növényi hormonok, amelyeket egyes gombák, például Fusarium moniliforme, Gibberella fujikuroi stb. tenyészetében és fejlettebb növényekben mutattak ki (Murocev, G.Sz., Agnisztyikova, V.N.: A gibberellinek, a növények hormonjai, 15-16. oldal, Mezőgazdasági Könyvkiadó, Bp. 1976). Gibberella fujikuroi tenyészetéből azonosított huszonnégy féle gibberellint ismertet B. t. Cross, R.H. Galt, J.R. Hanson, P.J. Curtis, J.F. Grove és A. Morisson a Chem. Soc. 2937-2953 (1963) helyen. A Fusarium moniliforme tenyésztése során nagyobb mennyiségben négy gibberellin termelődik, amelyek vékonyrétegkromatográfiásan elkülöníthetők és azonosíthatók. Ezek az (1) képletű gibberellinsav, melyet A3-mal jelölnek, a (II) képletű A4, a (III) képletű A7 és a (IV) képletű fujenal. Kromatográfiás vizsgálataink szerint a fermentáció korai szakaszában, kb. az 50. és 80. óra között főként A4 és A7 termelődik, amellett megjelenik a fujenal is. A fermentáció későbbi szakaszában, kb. a 120. órára jelentősen megnövekszik az A3 koncentrációja. Ennek magyarázatát a Muromcev, Agnisztyikova, idézett mű 22. oldalán közölt Phinney és Spector elmélete adja. A gibberellinek átalakulásának sémáját az A reakcióvázlaton mutatjuk be. Biológiai tesztek azt mutatják, hogy az A4, A7 és a fujenal a növények hossz és keresztirányú növekedését arányosan fokozzák, míg az A3 elsősorban a hosszirányú növekedést segíti elő. Kísérleteink során felismertük, hogy Fusarium moniliforme tenyésztése esetén az A4 és A7 termelése fokozható. Kidolgoztunk továbbá egy eljárást, amellyel a fujenal és az A4 és A7 jelű gibberellinek ipari méretekben tenyésztett Fusarium moniliforme tenyészetéből kinyerhetők. A találmány tárgya tehát eljárás Fusarium moniliforme tenyészetéből az A3 jelű gibberellinsav mellett termelődött gibberellinek kinyerésére. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a Fusarium moniliforme csökkentett levegőztetéssel kapott fermentlevének sűrítménye etil-acetátos extraktumából az A3 foszfát-pufferrel történt eltávolítása után dikálium-hidrogén-foszfáttal kinyerjük az A4-t és A7-t. Ezt a fázist nátrium-kloriddal és nátrium-szulfolauráttal, majd perlittel kezeljük, szűrjük, majd pH-beállítással kicsapjuk az A4-t és A7 -t. Az etilacetátos fázist víztelenítjük, kezdődő kristályosodásig bepároljuk, majd hűtés közben tovább kristályosítjuk. A kapott terméket acetonból átkristályosítva nyerjük a tiszta fujenalt. Az A4 és A7 kinyerésének másik módja, hogy a fermentlé sűrítmény refrakcióját nátrium-kloriddal legalább 12%-ra állítjuk be, a kapott csapadékot szűrjük. 2—4-szeres térfogatú vízben felvesszük, pH-ját semlegesre állítjuk, fehérjementesítjük, pH-ját 2,8 és 3,2 közötti értekre állítjuk, és a kicsapódott A4-t és A7-t szűréssel elkülönítjük. A fermentlé sűrítmény kisózásával kapott csapadékot feldolgozhatjuk úgy is, hogy a csapadékot megszárítjuk, a kapott porból a fehérje mellől etil-acetáttal kioldjuk az A4-t és A7-t, az így kapott oldatot 6,6 pFI-jú foszfátpufferrel extraháljuk, majd pirítással az A4 és A7 kálium-sóját kapjuk. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosíi tási módja szerint a Fusarium moniliforme tenyésztését az A3 termelést célzó fermentáció pH-jához képest 1,0— 1.5 értékkel magasabb pH-értéken kezdjük, majd a 80. órától kezdve táptalajliterenként 1 1/perc-ről 0,751/perc-re csökkentett levegőztetés mellett folytatjuk. Az így kapott 120 órás tenyészet leszűrt fermentlevét, amelynek pH-ja kb. 4,5, 35—40°C-on vákkumbepárlóban kíméletesen eredeti térfogatának egytizedére besűrítjük, pH-ját 3.5-re állítjuk, megszűrjük és ellenáramú etil-acetátos extrakcióval kinyerjük belőle a gibberellineket. Az etil-acetátos fázist igen kíméletesen 35—40°C-on egyharmadára besűrítjük és foszfátpufferrel eltávolítjuk belőle az A3-t. Itt a szokásos 6,2 pH-jú foszfátpuffer helyett a nagyobb szelektivitás érdekében 5,8 pH-jú pufferrel dolgozunk. Az etil-acetátos fázist tovább besűrítjük egyharmadára, és az A3-nyomok eltávolítása érdekében 0,2 mólos magnézium-acetáttal extraháljuk. Ennél a lépésnél azért előnyösebb magnézium-acetáttal dolgozni, mint foszfátpufferrel, mert a magnézium-acetát sok pigmentanyagot is kiold, ezzel megkönnyíti a további munkát. A kapott A3-mentes etil-acetátos fázisból fele térfogatú 0.5 mólos dikálium-hidrogén-foszfát oldattal több lépésben extraháljuk az A4-t és A7-t. Az extrakció teljességéről Folin-Ciocalteu reagenssel győződünk meg. A dikálium-hidrogén-foszfátos fázisokat egyesítjük, így 6,6 pH-jú, pigmenttel szennyezett frakciót kapunk. Az össztérfogatra számítva 10% nátrium-kloridot, 0,01% nátrium-szulfolaurátot és 0,01% hidrofób perlitet adunk hozzá, és 20 perc múlva leszűrjük. A szürletet +10°C alá hűtjük le. pH-ját 1 n sósavval 2,8—3,0 értékre állítjuk be, így az A4 és A7 fehér, pelyhes csapadék formájában kiválik. Az A4 és A7 vízben igen csekély mértékben oldódik, mezőgazdasági felhasználáshoz célszerű kálium-sóvá alakítani. Ezt célszerűen úgy végezzük, hogy a fenti pelyhes formában kiváló csapadékot az elegyből fele térfogatú etil-acetáttal háromszor kirázzuk, és az etil-acetátból az A4-t és A7-t azonos mennyiségű kálium-hidrogén-karbonát-oldattal kivonjuk. A biológiai aktivitás védelme érdekében itt vigyázni kell arra, hogy a pH semmiképpen se haladja meg a 7,0—7,5 értéket. A kálium-gibberellátos vizes oldatot maximum 50°C-on végzett bepárlással etilacetát mentesítjük, pH-ját 6,0-ra állítjuk és porítva szárítjuk vág}' liofilezzük. Miután a fermentlésűrítmény etil-acetátos extraktumából kinyertük az A4-t és A7-t, az etil-acetátos fázist száraz CMC-vel víztelenítjük, és vákuumbepárlóban kezdődő kristályosodásig bepároljuk, majd a kristályosítást hűtés közben folytatjuk. A kapott kristályokat acetonból átkristályosítva lemezes kristályok formájában kapjuk a fujenalt. Nagy tisztaságú fujenal nyerhető, ha az acetátos oldathoz 1:5 arányban desztillált vizet adunk. Így a fujenal amorf, fehér por formájában csapódik ki. A Fusarium moniliforme fermentlevéből az A4 és A7 szelektív kinyerésének másik módja azon alapszik, hogy az A4 és A7 10% refrakció felett és 3,5-nél alacsonyabb pH-nál vizes közegből kicsapható. A vizes sűrítmény refrakciója a bepárlás során 10 körüli értéket ér el, pH-ját 3.0 és 3.5 közötti értékre állítjuk be. A sűrítmény reakcióját nátrium-klorid adagolásával legalább 12%-ra növeljük. Ilyen körülmények között az A4 és A7 nagymennyiségű fehérje kísérletében kicsapódik. A csapadékot 0,2% perlittel tömörítjük, kiülepedés után dekantáljuk. A dekantált csapadékot 3,0 pH-jú sósavas vízzel felvesszük, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
