188487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Fusarium Moniliforme tenyészetéből az A3 jelű gibberelinsav mellett termelődött gibberellinek kinyerésére
1 188 487 2 pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk be, és így az A4-t és A7-t oldatba visszük. Az így kapott oldatból denalurálással kicsapjuk a reverzibilisen oldódó fehérjéket, és a refrakciót nátrium-kloriddal 12%-ra állítjuk be. A kicsapódott fehérjékről dekantáljuk, majd szűrjük az oldatot. A szürlet pH-ját 5%-os sósavval lassú keverés közben 3,0-ra állítjuk be, így az A4 és fehér szűrhető csapadék formájában kicsapódik. Ezzel a módszerrel 80%-os tisztaságú preparátumot kapunk, melyet a már leírt módon káliumsóvá alakítva a mezőgazdaságban közvetlenül felhasználható készítményt kapunk. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy ipari méretekben teszi lehetővé az A3 jelű gibberelünsav mellett termelődő, eddig nem hasznosított gibberellinek előállítását. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. 1. példa Fusarium moniliforme fermentlevének 270 1 4,5 pH- jú sűrítményét pH-jának 3,5 értékre állítása után 180 1 etil-acetáttal extraháljuk az A3 teljes extrakciójáig. A 180 1 etil-acetátos fázist vákuumbepárlóban 35—40°C-on 60 1-re bepároljuk. Kétszer 15 1 6,2 pH-jú káliunt-dihidrogén-foszfát-kálium-hidroxid pufferrel extraháljuk. A 30 1 puffer pH-ját 10%-os sósavval 3,1-re állítjuk be, és etil-acetáttal újra extrahálva kinyerhetjük az A3-t. Az etil-acetátos fázist kezdődő kristályosodásig vákuumban bepároljuk. A kálium-dihidrogén-foszfát-kálium-hidroxid pufferes extrakció után visszamaradt 60 1 etil-acetátot egyharmadára bepároljuk. A kapott 20 1 etil-acetátos oldatot kétszer 5 1 0,2 mólos magnézium-acetáttal A3 mentesítjük. Ebből az A3 újabb etil-acetátos extrakcióval kinyerhető. Az A3 mentes 20 1 etil-acetátból kétszer 5 1 0,5 mólos dikálium-hidrogén-foszfáttal extraháljuk az A4-t és A7-t. A kapott 10 1 dikálium-hidrogén-foszfátos fázishoz, melynek pH-ja 6,6, 1 kg nátrium-kloridot és 1 g nátrium-szulfolaurátot, valamint lOghidrofób perli tét adunk, és 20 perc után szűrjük. A kapott szürletet + 10°C alá hűtjük, majd pH-ját 1 n sósavval 2,8 és 3,0 közötti értékre állítjuk be. A kiváló amorf A4-t és A7-t szűrjük, vagy centrifugáljuk. A kapott A4-t és A7-t vékonyrétegkromatográfiásán azonosítjuk DC-Plastikfolien Kieselgel 60 típusú Merck gyártmányú lemezen, futtatószerként n-butanol és 1,5 n ammónium-hidroxid 3:1 arányú elegyét használjuk. Felszálló kromatográfiát végzünk. Előhívóként 96%-os etanol és koncentrált kénsav 95:5 arányú elegyét használjuk, az előhívott kromatogrammot UV megvilágításban a lemez előzetes 120°C-on 20 percig végzett melegítése után értékeljük. Standardként az angol Imperial Chemical Industries által gyártott A4 és A7 preparátumot használjuk. Rf = 0,61. Az így nyert anyag vízoldékonysága igen csekély, mezőgazdasági hasznosítása viszont vízoldékony kálium-só formájában lehetséges. A káliumsót úgy állítjuk elő, hogy a dikálium-hidrogén-foszfátos frakció pigmentmentesítés utáni szürletének pH-ját 2,8—3,0 értékre állítjuk be, és háromszor fele térfogatú etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos extraktumból ekvimoláris mennyiségű kálium-hidrogén-karbonáttal extraháljuk az A4 és A7 káliumsóját. Max. 50°C-on végzett bepárlással etil-acetát-mentesítjük az oldatot, majd pH-ját 6,0-ra állítjuk be, és porítjuk vagy liofilezzük. A dikálium-hidrogén-foszfátos extrakció után visszamaradt etil-acetátot 0,1/i szálas CMC-vel 1 óra hosszat víztelenítjük, majd vákuumbepárlóban 35—40°C-on kíméletesen kezdődő kristályosodásig bepároljuk, majd a kristályosítást hűtés közben folytatjuk. A kapott fujenal fizikai és kémiai jellemzői :- vízben oldhatatlan,- o.p. : 169—170°C,- [<x]D =-85,18° (metanol, 0,42 g/100 ml, 20°C),- ÍR spektrum: 3075 cm’1 (=CH2) 2697 cm’1 (CH, aldehid) 1860 cm“1 (aldehid) 1785 cm’1 1725 cm’1 (aldehid) 1655 cm’1 (C=CH2) 918 cm’1 (aldehid) 895 cm’1 (=CH,)- UVX (nm): 216(840) 220 (500)- Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat: DC—Plastikfolien 60 típusú Mereck gyártmányú lemezen futtatószerként n-butanol és 1,5 n ammónium-hidroxid 3:1 arányú elegyét használva felszálló kromatográfiát végzünk, előhívószerként etanol és kénsav 95:5 arányú elegyét használjuk. 105°C-on 20 percig tartó melegítés után UV megvilágításban bíbor színű fluoreszcenciát mutat. Rf = 0,82.- Folin-Ciocalteu reagenssel nem mutat színreakciót, csak 10 óra elteltével. Mezőgazdasági felhasználás céljaira a fujenal káliumsóját a következőképpen készítjük: a fujenalt acetonban oldjuk, majd ötödrész desztillált víz hozzáadása után óvatosan, állandó keverés mellett, vigyázva arra, hogy a pH ne haladja meg a 8,0 értéket, 5%-os kálium-hidroxidot adagolunk ekvimoláris mennyiségben. 1 óra reakcióidő után 0,5 n sósavval 6,5-re állítjuk a pH-t erős keverés közben. Majd a kivált csapadékot leszűrjük és szárítjuk vagy liofilezzük. 2. példa 10 m3 A4-re és A7-re nézve 50—70 gamma/ml koncentrációjú, 4,5 pH-jú szűrt fermentlevet vákuumbepárlóban 35—40 °C-on 1 m3-re sűrítjük. A sűrítmény refrakciója 9,5—10,0 pH-ját 3,3 értékre állítjuk be. A refrakciót nátrium-klorid adagolásával 12 értékre állítjuk, és a fehérjékkel együtt kicsapódó A4 és A7 tömörítése céljából 0,1% perlitet adagolunk, majd ülepítjük. A folyadékfázist dekantáljuk a csapadékról, és a csapadékot, melynek térfogata kb. 30 1, 3 pH-jú sósavas vízzel A3 mentesre mossuk. Az A3 mentes csapadékot 90 literre egészítjük ki 7 pH-jú vízzel. A visszaoldódott fehérjéket 5 percig tartó, 65°C-on végzett hőkezeléssel kicsapjuk, majd 12% refrakcióig nátrium-kloridot adagolunk. Az igy kapott oldatot ülepítjük, dekantáljuk, majd szűrjük. A szürlet pH-ját lassú keverés mellett 5%-os sósavval pH = 3-ra állítjuk be. A kicsapódó A4-t és A7-t leszűrjük, és szárítjuk. Szadalmi igénypontok 1. Eljárás Fusarium moniliforme tenyészetéből azA3 jelű gibbereilinsav mellett termelődő fujenal és A4 és A^ jelű gibberellinek kinyerésére, azzal jellemezve, hogy a) a Fusarium moniliforme fermentleve sűrítményének etil-acetátos extraktumából az A3 eltávolítása után dikálium-hidrogén-foszfáttal kinyerjük az A4 és A7 jelű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
