188434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás baktériumos talajoltóanyag előállítására
1 188 434 2 elfogadott nézet is, miszerint a Rhizobiumok csak a pillangós növények gyökérgümőiben képesek a levegő nitrogénjét fixálni. Ezzel a Rhizobiumok alkalmazhatósága nagymértékben bővült. A találmány szerint előállítható talajoltóanyag 5 tehát Azotobactereket és - az alkalmazási céltól függően - adott esetben Rhizobiumokat is tartalmaz, megfelelő tápanyagokkal és adott esetben biológiailag aktív egyéb adalékanyagokkal együtt. A találmány szerint az Országos Közegészség- 10 ügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 00238 sz. alatt letétbe helyezett Azotobacter chroococcum törzset és az ugyanott 00239 sz. alatt letétbe helyezett Rhizobium törzset alkalmazzuk. 15 A találmány tárgya tehát eljárás baktériumos talajoltóanyag előállítására. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy az OKI 00239 jelű Azotobacter chroococcum törzset nitrogénmentes folyékony tápközegben süllyesztett tenyészetben 28 °C 20 körüli hőmérsékleten 24-80 órán keresztül tenyésztjük, utána a tenyészlét besűrítjük vagy porrá szárítjuk és a sűrítményhez, illetve porhoz- adott esetben vitaminokat, növekedésszabályozó anyagokat és nyomelemeket, és 25- adott esetben a fenti körülmények között fermentált OKI 00238 jelű Rhizobium törzs tenyészlevét vagy annak sűrítményét vagy szárítással nyert porát adjuk. A tenyésztést előnyösen nagy térfogatú edények- 30 ben végezzük. A fermentlé aktivitását a hormonok meghatározásával, valamint a - kiinduláskor nitrogénmentes - tápközeg nitrogén-tartalmának meghatározásával mérjük. A fermentálás végén a sejtszám mintegy 2,4-2,8 milliárd/ml. A fermentlé szá- 35 razanyaga kb. 20% fehérjét tartalmaz, ami egyben a baktérium hatékonyságát is jellemzi. A fermentálás befejeztével nyert tenyészlét bepároljuk vagy porrá szárítjuk. A bepárlást vákuumban, 35 °C körüli hőmérsékletben végezzük, elő- 40 nyösen eredeti térfogatának 1/5 - 1/10 részére pároljuk be a tenyészlét. A szárítást alacsony hőmérsékleten végezzük, hogy a mikroorganizmusok meg ne károsodjanak. Porlasztva szárítás esetén a belépési hőmérséklet előnyösen 50-60 °C, a kilépési 45 hőmérséklet 130-140 °C. Amennyiben örvénykamrás szárítót alkalmazunk, a szárítási hőmérséklet előnyösen 35 "C körüli. A kapott oltóanyaghoz adhatunk még biológiailag aktiv anyagokat, például B vitamint, gibberel- 50 lint, heteroauxint, jóllehet az Azotobacter maga is szintetizál ilyen anyagokat (40-50 órás tenyésztés alatt pl. 3-6 pg/ml heteroauxint és 10-20 pg/ml gibberellint). Az oltóanyagot kiszereljük és fénytől védve, hűvös helyen tároljuk. 55 Az alábbi példákkal a találmány szerinti eljárást közelebbről ismertetjük. A példákban használt tápközegek összetétele az alábbi: AZ-i 60 Káliumdihidrofoszfát 0,3 g Foszkál 0,3 g Citromsav 0,2 g Magnéziumszulfát 0,3 g Káliumszulfát 0,2 g Nátriumklorid 0,4 g Vas II klorid 0,05 g Kálciumkarbonát (precipitált) 6,0 g Sacharose 20,C g Nyomelemoldat 1,0 ml Nyc'nelemoldat: Bórsav 2,0 g Kobaltszulfát 0,2 g Ammóniummolibdenát 5,0 g Káliumjodid 0,5 g Cinkszulfát 0,2 g Alumíniumszulfát 0,3 g Nátriumbromid 0,5 g AZII Káliumdihidrofoszfát 0,2 g Foszkál 0,3 g Citromsav 0,2 g Magnéziumszulfát 0,3 g Káliumszulfát 0,2 g Nátriumklorid 0,4 g Vas (II) klorid 0,05 g Ka'ciumkarbonát (precipitált) 7,0 g Melasz 40,C g Phylamalt 10,C g Nyomelemoldat (mint az 1,0 ml AZ-I) AZ m A táptalaj komponensei mint 20,0 g az AZ-I, de Agar-agar ad 1000 ml csapviz, pH önbeálló, 6,5 ad 1000 ml csapvíz ad 1000 ml csapvíz pH önbeálló, 6,5 ad 1000 ml táptalajhoz 1. példa Azotobacter chroococcum szaporítása 100—100 ml AZ-I jelű tápközeget tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikokat oltunk a liofilizált állapotban fenntartott törzzsel. A tápközeget ezt megelőzően autoklávban 120°C-on 30 percen keresztül sterilizáltuk. A lombikokat 48 órán keresztül 28 °C hőmérsékleten síkkörrázógépen rázzuk 300 perc” ' frekvenciával. Az elkészült fermentlevek alkalmasak üzemi oltóanyag készítésére, szélesztésre és liofilizálásra. 2. példa Azotobacter chroococcum szélesztése A szélesztéshez AZ-III jelű táptalajt használunk, ennek összetétele az AZ-I-nak felel meg azzal a különbséggel, hogy 2% agar-agart is tartalmaz, hogy a táptalaj megszilárduljon. A folyósított táptalajt Petri csészékbe töltjük és az 1. példában megadott módon sterilezzük. A megdermedt táptalajokat beoltjuk és 28 °C-os termostátba helyezzük. 48 óra elteltével értékeljük a telepeket. A megfelelő telepeket elkülönítjük és újabb rázott lombikba oltjuk. 3. példa 100 liter AZ-I jelű tápközeget 120 °C-on 45 percen át sterilezünk, majd a 2. példa szerint lombikban előállított oltóanyaggal beoltjuk, amikoris 0,5% lf% oltótenyészetet használunk. A tenyészlét 1 liter/liter.perc mennyiségű levegővel levegőztetjük, és 28 °C-on 48 órán át irtkubáljuk. 3
