188425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamint és egyéb korrinoidokat tartalmazó fermentlevek feldolgozására és B12-vitamin koncentrátumok előállítására
1 188 425 2 ciós rendszerben tisztítunk: a szüretien fermentlevet folyamatos áramoltatással két egyenként 50 liter hasznos térfogatú és 10-10 liter DIAION HP- 20 makroretikuláris adszorpciós gyantát (a Mitsubishi japán cég gyártmánya) tartalmazó készüléken áramoltatjuk át 200 1/óra átfolyási sebeséggel. Ennek során a fermentlében jelenlevő extracelluláris szennyezőanyag főtömege adszorbeálódik a gyantán. A fermentlé átfolyatása után a készüléket 100 liter vízzel utánamossuk. Az igy részlegesen tisztított fermentléhez 250 ml 1%-os KCN vizes oldatát adunk, majd a pH-értéket 50%-os vizes kénsav folyamatos adagolásával 4-re állítjuk be, majd a fermentlevet átfolyó rendszerben 10 perc tartózkodási idővel 110 °C-ra melegítjük, amikor is a sejtek feltáródnak és korrinoidok a sejtekből kiszabadulva a fermentlében oldódnak. Az így feltárt fermentlevet hőcserélő-rendszeren átvezetve 30 °C alá hűtjük, majd egy második kéttagú, tagonként 50 liter hasznos térfogatú, sorbakapcsolt mozgóágyas adszorpciós berendezésbe vezetjük 200 1/óra sebességgel, amely tagonként 20- 20 liter DIAION HP-20 makroretikuláris adszorpciós gyantát tartalmaz. A művelet során a korrinoidok a gyantán adszorbeálódnak; a készüléken átfolyt, számottevő korrinoidot már nem tartalmazó levet kiöntjük. Ezután az előzővel ellentétes irányban, 1 m3/óra sebességgel 250 liter vizet vezetünk az adszorpciós készüléken keresztül a berendezésben maradt feltárt sejtmaradék eltávolítása céljából, majd 200 liter, ammóniumhidroxiddal 9-10 pH-értékre állított vizet vezetünk át a készüléken, amely a lipoidokat és nem azonosított sárga és barna színű szennyező anyagokat távolítja el a korrinoidokat megkötve tartalmazó adszorbensről. A bázisos oldattal kezelt gyantát vízzel semlegesre mossuk, majd 200 liter metanol 100 1/óra sebességgel történő rávezetésével eluáljuk a korrinoidokat az adszorbensről. Az eluátumból a metanolt vákuumban, legfeljebb 50 °C hőmérsékleten bepároljuk, amikor is 10 liter vizes oldat marad vissza, amely 45,2 g B12-vitamint és 7,3 g III-faktort tartalmaz, összes szárazanyag-tartalma 331 g, a szárazanyagra számított fajlagos hatóanyagtartalom tehát 15,9%. A kapott koncentrátumban tehát a hatóanyag betöményítésének mértéke (a kiindulási fermentlére számítva) 200-szoros, a szárazanyagra számított tisztulás mértéke 92-szeres; a kiindulási fermentlé hatóanyagtartalmára számított hatóanyaghozam 87%. A fenti módon kapott vizes koncentrátumból porlasztószárítása útján kapott száraz termék közvetlenül felhasználható nagy B12-vitamin-tartalmú takarmányadalékként; ismert módon történő extrakció és ioncserés tisztítás útján pedig kristályos B12-vitamint állíthatunk elő a vizes koncentrátumból. 2. példa Propionibacterium shermanii mikroorganizmussal lefolytatott aszeptikus fermentáció útján kapott, 45 mg/1 B12-vitamint és 1,35% szárazanyagot tartalmazó 5,9 pH-értékü fermentlé 100 literjébe 2 liter Amberlite XAD-2 makroretikuláris gyantát keverünk, majd 1 órai lassú keverés után a gyantát szűréssel elkülönítjük olyan módon, hogy a szűrő a fermentlében levő ép mikroorganizmusokat átengedje és a szűrletként kapott tisztított fermentlevet 5 pH-értékre állítva ismert módon, cianid-ionok jelenlétében feltárjuk. A feltárt és 30 °C hőmérsékletre lehűtött fermentlé pH-értékét 5 és 5,5 közöttire állítjuk és 5 liter Amberlite XAD-2 gyantát keverünk hozzá. Háromórai keverés alatt az oldatban levő BJ2-vitamin teljes mennyisége a gyantán adszorbeálódik. \ gyantát szűréssel elkülönitjük, vízzel átmossuk, majd 10 liter 60%-os vizes acetonnal való keverés ltján eluáljuk a B12-vitamint a gyantáról. Az eluálást további 5 liter 60%-os vizes acetonnal megismételjük és az egyesített eluátumból az. acetont vákuumban lepároljuk. A visszamaradó 3 liter' vizes oldat 3,96 g B12-vitamint tartalmaz, szárazanyag-tartalma 27,0 g, a fajlagos hatóanyagtartalom tehát 14,66%. A kapott koncentrátumban a hatóanyag-hozam (a kiindulási fermentlé hatóanyagtartalmára számítva): 88%. A vizes koncentrátum további feldolgozása az 1. példában említett módon történhet. 3. példa Az 1. példában említett fermentlé 10 literjét egy 200 ml Amberlite XAD-7 gyantát tartalmazó mozgóágyas adszorpciós oszlopon vezetjük át. Az átfolyt lé pH-értékét sósavval 3 és 3,5 közöttire állítjuk be, 2 ml 1%-os KCN oldatot adunk hozzá, majd 10 percig 80 °C hőmérsékleten tartjuk, majd az így feltárt levet 20-30 °C-ra hűtjük és egy 200 ml Amberlite ER-180 adszorpciós gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük át. Az átfolyt levet kiöntjük, a gyantát pedig először vízzel, majd 10 pH-értékű híg kálium-hidroxid-oldattal, végül semleges reakcióig ismét vízzel mossuk. A gyantáról a hatóanyagot 2 liter 70%-os vizes metanollal eluáljuk. Az eluátumból a metanolt vákuumban bepároljuk. A visszamaradó 500 ml vizes oldat 216 mg B12-vitamint tartalmaz; szárazanyag-tartalma 1,2 g. A szárazanyagra számított fajlagos hatóanyagtartalom 18%, a kiindulási fermentlé hatóanyagtartalmára számított hozam 83%. A kapott koncentrátum az 1. példában említett módon dolgozható fel száraz takarmányadalék, illetőleg kristályos B12-vitamin előállítására. 4. példa Szennyvíziszapos inokulálással lefolytatott szeptikus aerob fermentációval kapott, 26 mg/1 B12- viíamint tartalmazó fermentlé 10 literjét egy 100 ml Amberlite XAD-7 gyantát, majd ezt követően egy 100 ml Amberlite ER-180 gyantát tartalmazó adszorpciós oszlopon vezetjük át. Az így előtisztított lé feltárását és további feldolgozását a 3. példában leírt módon végezzük. Az eluátum bepárlása után kapott vizes oldat 202 mg B12-vitamint tartalmaz, összes szárazanyag-tartalma 900 mg. A fajlagos ha5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6b 5
