188211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens glikozilált hemoglobin meghatározására
1 2 188211 , lyek különböző mennyiségű glikozilált hemoglobint tartalmaznak, felrajzolható egy olyan kalibrációs görbe, amelynek alapján ismeretlen mintákban lévő összhemoglobin glikozilált része meghatározható. A glikozilált és nem glikozilált hemoglobinnak a haptoglobinnal szemben tanúsított kötési viselkedésében lévő különbség egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyekre kötési hatással bíró vegyület hozzáadásával növelhető. Ilyen vegyületek ismertek. Példaként a következők említhetők: szerves foszforvegyületek, így 2,3-difoszfo-glicerinsav és az inozit-hexafoszfát, szerves szulfátok, így inozithexaszulfát, és karbonsavak, így a mellitsav. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin haptoglobin segítségével történő differenciálását a hemoglobin allosztérikus effektorhelyeire hatással levő egy vagy több vegyület hozzáadásával hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárás végrehajtására a szakembereknek egy sor olyan anyag áll rendelkezésére, amely kötési hatással vannak az allosztérikus effektor-helyre. A találmány értelmében különösen alkalmas az inozin-hexafoszfát, 2,3-difoszfo-glicerinsav és mellitsav. Ezeket a hemoglobin-tartalomra vonatkoztatva legalább ekvivalens mennyiségben adjuk az oldathoz. Általában előnyös azonban, ha ezeket az anyagokat feleslegben, előnyösen 10-200-szoros moláris feleslegben használjuk. Inozit-hexafoszfátnak glikozilált és nem glikozilált hemoglobin haptoglobinnal szembeni kötési viselkedésére gyakorolt befolyása a 2. ábrából látható. Ezen egy haptoglobint tartalmazó oldat fluoreszcenciaintenzitásának lefutása látható az idő függvényében inozit-hexafoszfát és nem glikozilált hemoglobin hozzáadása után. A mérési görbék lefutása egyértelműen mutatja, hogy inozit-hexafoszfát jelenlétében a glikozilált hemoglobin lényegesen gyorsabban kötődik haptoglobinhoz, mint a nem glikozilált hemoglobin. Adott esetben célszerű a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása előtt a rendesen az eritrociták hemolízise után jelenlévő hemoglobint methemoglobinná átalakítani. A szakembernek erre a célra egy sor ismert módszer áll rendelkezésére, például kálium-[hexaciano-ferrát(III)]-mal vagy nátrium-nitrittel végzett oxidáció. Előnyös mind a hemoglobint, mind adott esetben a methemoglobint egy vagy több hem-kötő ligandummal stabilizálni. Lényegében minden lehetséges hem-kötő ligandum megfelel a találmány szerinti eljárás részére. Különösen előnyösek az alkil-izocianidok, oxigén, szénmonoxid és nitrogénmonoxid a hemoglobin részére, valamint a fluoridok, azidok, cianidok és a víz hem-kötő ligandumokként a methemoglobin részére. A hem-kötő ligandumok koncentrációjának a mérőoldatban legalább ekvimolárisnak kell lennie a hem-koncentrációval. Mivel minden egyes hemoglobin molekula négy hem-maradékot tartalmaz, ennek a minimális koncentrációnak a hemoglobin-koncentráció négyszeresének kell megfelelni. Előnyösen azonban a hem-kötő ligandumokat is nagy, előnyösen I0-I05-szeres moláris feleslegben alkalmazzuk. í Célszerű továbbá a mérőoldathoz haptoglobinnal való egyesítés előtt valamilyen ionkötés-stabilizáló szert hozzáadni. Ilyen, az ionos kötésre stabilizáló hatással bíró anyagok például polietiléngliko- 5 lók és szacharóz. A hemoglobin a vérben két alakban fordul elő: az oxi- és dezoxi-formában. A találmány szerinti eljárás esetében célszerű a hemolizált vérmintában lévő hemoglobint egységes formába hozni. Ez lehet 10 mind az oxi- mind a dezoxi-forma is. Előnyösen a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása előtt az egész hemoglobin-tartalmat a dezoxi-formába alakítjuk át. Az oxi-forma dezoxiformába, illetve a dezoxi-forma oxi-formába való 15 átalakítására szolgáló módszerek a szakembernek közismertek. Például az oxi-forma ditionit vagy más redukálószerek segítségével átalakítható a dezoxi-formává. Egészen különösen előnyös a találmány szerinti 20 eljárásnak az a kivitelezési formája, amelyben a hemolizált vérmintában lévő hemoglobint valamilyen redukálószerrel, például nátrium-ditionittal a dezoxi-formába alakítjuk, egy vagy több, az allosztérikus effektorheiyre kötési hatással rendelkező 25 anyaggal és/vagy egy vagy több hemkötő ligandummal elegyítjük, és utána hozzuk érintkezésbe haptoglobinnal. Ezen a módon elérjük, hogy egy minta összhemoglobin-tartalmának csak a glikozilált részét köti meg a haptoglobin, és kvantitatíve 30 meghatározható. A haptoglobint a hemoglobinra számolva legalább ekvimoláris mennyiségben alkalmazzuk. Itt is előnyös azonban egy jelentős felesleg. Előnyösen a 2-50-szeres moláris mennyiséget alkalmazzuk. 35 A haptoglobin érintkezésbe hozható szabad formában a mérőoldattal. Ebben az esetben célszerűen az összhemoglobin glikozilált részletét határozzuk meg homogén fázisban, ismert módszerekkel. A glikozilált részlet például a fluoreszcenciakioltá- 40 sós módszerrel mérhető Nagel és Gibson [J. Bioi. Chem. 242, 3428 (1967)] szerint. További lehetőség adódik szabad és haptoglobinhoz kötött hemoglobin pszeudoperoxidáz aktivitásának eltérő pH- függőségéböl [lásd Kawamura és mtsai., Biochem. 45 Biophys. Acta 285, 22-27 (1972)]. Mivel a haptoglobin a hemoglobin természetes antitestjeként tekinthető, a haptoglobin és hemoglobin közötti kölcsönhatás meghatározására szolgáló további módszerekként bizonyos, az immun- 50 diagnosztikából ismert eljárások, így a radioimmun-analízis, enzimimmun-analízis és egyebek is számításba jönnek. Az is lehetséges továbbá, hogy a haptoglobint valamilyen hordozón fixáljuk. Ebben az esetben a 55 meghatározási eljárás úgy végezhető, hogy vagy a) a haptoglobinnal preparált hordozót mártjuk a hemolizált, adott esetben előkezelt vérmintába, vagy b) az előkezelt vérminta meghatározott mennyigQ ségét cseppentjük a haptoglobin-hordozóra, vagy c) meghatározott mennyiségű előkezelt vérmintával eluáljuk a haptoglobint a hordozóról. Hordozóanyagként az analitikai kimutatási reagensekhez szokásos hordozók, így papír, cellulóz, _5 műszálfilc, pórusos műanyagok és hasonlók megfe-3
