188211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens glikozilált hemoglobin meghatározására
1 188 211 2 lelök. Az. elkészítés haptoglohin-tartalmú oldatba való bemártással vagy ezzel való bepermetezéssel történhet. A haptoglobin kovalensen köthető valamilyen oldhatatlan hordozóra is. Hordozóként minden szokásos, proteinek fixálására alkalmas hordozóanyag megfelel. A haptoglobinnak a hordozóanyaggal való kapcsolása a szakember által általánosan ismert módok valamelyike szerint történhet. A hordozóhoz kötött haptoglobint a hemolizált vérmintához adjuk hozzá, amely adott esetben a fent említett adalékanyagokkal van elegyítve. Elegendő érintkezési idő, például körülbelül I perc múlva az oldhatatlanná tett haptoglobint a megkötött glikozilált hemoglobin-résszel elválasztjuk, és a glikozilált hemoglobint szokásos módon vagy saját színe alapján közvetlenül fotometriásan vagy pszeudo-peroxidáz aktivitása alapján meghatározzuk. A haptoglobín-tartalmú hordozó oszlopba töltve is alkalmazható, amelyen a hemolizált és esetleges adalékokkal ellátott vérmintát átengedhetjük. A hemoglobin glikozilált része ennél az eljárásmódnál a hordozóhoz kötött haptoglobinon marad, és igy könnyen elválasztható az oldalban maradt nem glikozilált hemoglobin-résztől. Ebben az esetben célszerű a meg nem kötött, nem glikozilált hemoglobin-részt azeluátumban meghatározni. A HbA,tartalom azután az összhemoglobin és a mért, nem glikozilált hemoglobin-rész különbségéből adódik. A találmány tárgyát képezi továbbá a glikozilált hemoglobin vérmintában való, az eritrociták szokásos hemolízise utáni meghatározására szolgáló reagens, amit az jellemez, hogy 50-200 mmól/liter, 6.0-7.0 pH-értékű pufferrendszert, 20-160 mg/liter szabad vagy hordozóhoz kötött haptoglobint, valamint adott esetben 0,05-0,2 mmól/liter egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyre kötési befolyással bíró anyagot, 0,5-100 mmól/liter egy vagy több hem-kötő ligandumot és/vagy 0. 25.1000 mmól/liter ionos kötésekre stabilizáló hatású polihidroxi-vegyületet tartalmaz. A találmány tárgya továbbá glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálására szolgáló olyan reagens, amely szabad vagy hordozóhoz kötött formában haptoglobint tartalmaz. A mellékelt ábrák magyarázata a következő: 1. ábra: Haptoglobin oldat fluoreszcenciaintenzitásának felvétele glikozilált (1. görbe), illetve nem glikozilált (2. görbe) hemoglobin hozzáadása után. 1, = fluoreszcenciaintenzitás t időpontra; 100 = fluoreszcenciaintenzitás a reakció lefutása után. 2. ábra: Haptoglobin oldat fluoreszcenciaintenzitásának felvétele glikozilált hemoglobin és inozithexafoszfát (1. görbe), illetve nem glikozilált hemoglobin és inozit-hexafoszfát (2. görbe) hozzáadása után. 1, = fluoreszcenciaintenzitás t időre; 100 = fluoreszcenciaintenzitás a reakció lefutása után. 3. ábra: A haptoglobinhoz kötött hemoglobin függése az összhemoglobinban lévő glikozilált hemoglobin százalékos részarányától. A következő példák szemléltetik a találmányt: 1. példa: Egy olyan oldatból, amely 0,3 mmól/liter kálium-[hexaciano-ferrát(lII)]-at, 25 mmól/liter nátrium-fluoridot és 45,5 mg/liter humán eredetű haptoglobint (vegyes típusú) tartalmaz 100 mmól/liter koncentrációjú 6,7 pH-jú foszfálpufferban, 2,2 ml-t adagolunk be egy mérőküvettába. Hozzáadunk 100 pl 0,05%-os glikozilált hemoglobin oldatot, amely szintén 0,3 mmól/liter kálium-fhexacianoferrát(lll)]-at és 25 mmól/liter nátrium-fluoridot tartalmaz, majd utána időben követjük a fluoreszcenciaintenzitás lefutását (gerjesztési hullámhossz: 280 nm); emissziós hullámhossz: 330 nm). A mérési eredményt az 1. ábrán az 1. görbén ábrázoljuk. Hasonló módon, mint az előbb leírtak, megmérjük a fluoreszcenciaintenzitás lefutását úgy is, hogy a mérőoldathoz a glikozilált hemoglobin helyett nem glikozilált hemoglobint adunk. Az eredményt az 1. ábrán a 2. görbén ábrázoljuk. 2. példa: A/ 1. példában megadottakhoz hasonlóan mérőoldatokat készítünk. A foszfál-puffer helyett azonban egy 0,05 mólos 6,7 pH-jú bisz-trisz-puffert adunk hozzá. [Bisz-trisz-puffer = N,N-bisz(2- hidroxi-etil)-imino-trisz.(hidroxi-metil)-metán]. A glikozilált, illetve a nem glikozilált hemoglobin hozzáadása előtt a mérőoldatokhoz 0,2 mmól/liter inozit-hexafoszfátot adunk. A fluoreszcenciaintenzitás időbeli felvételét a 2. ábrán ábrázoljuk. 3. példa: Haptoglobin - Scph arose k é szíté se. 20 mg humán eredetű (vegyes típusú) haptoglobint (Fa. Behringwerke AG) kapcsolunk 4 g brómciánnal aktivált Sepharose-zal Klein és Mihaesco eljárása szerint [Biochem. und Biophys. Research Commun. 52, 774-778 (1973)]. A kapott hordozóra kötött haptoglobulin-készítményt 16 g inaktív Sepharose hozzáadásával hígítjuk. így olyan Sepharose-hoz kötött haploglobin-készítményt kapunk, amelynek kötési kapacitása 5 x 10 9 g hemoglobin/'l g nedves készítmény. A haptoglobin Sepharose-ltoz kötött hemoglobin meghatározása. I ml 0,05 mól/liter koncentrációjú 6,70 pH-jú bisz-trisz-pufferral készített 8 x 10 1 mól/liter koncentrációjú hemoglobin oldatot a dezoxi-forniába való átalakítás céljából körülbelül 5 mg nálriumdilionittál reagáltatunk. Ezután egymás után inozit-hexafoszfátot és n-bulil-izocianidol adunk hozzá a következő koncentrációkban: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
