188077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új antibiotikus hatású BMG162-AF2 előállítására
1 188 077 2 A találmány tárgya eljárás az új, az (I) képlettel jellemezhető BMG162-aF2 antibiotikum előállítására. Az antibiotikus hatású (I) képletű vegyület tumor kezelésére hasznosítható melegvérűeknél. Az (I) képletű vegyület a Bacillus laterosporus specieszhez tartozó valamelyik, a BMG162-aF2 termelésére képes mikroorganizmustörzs alkalmas táptalajon végzett tenyésztése, majd a kapott tenyészetből elkülönítés útján állítható elő. Az (I) képletű vegyület termelésére képes Bacillus-nemzetségbeli törzsekre példaképpen megemlíthetjük a Bacillus BMG162-aF2 törzset, amelyet jelen bejelentésünk feltalálói Japánban a Tochigi megyében található Taihei hegységben vett talajmintából izoláltak. További ilyen törzs a Bacillus laterosporus OUT 8139. A BMG162-aF2 törzs tenyésztési és taxonómiai jellemzői a következők: 1) Mikroszkopikus morfológia A BMG162-aF2 törzs nem állandó Gram-reakciót mutat, spórái vannak és pálcikaalakú egyedeinek mérete 0,6-0,8 • 2-3,5 mikron. Lateralis flagellával, vagyis egyik végéhez kapcsolódó ostorral rendelkezik és aktív mozgékonyságot mutat. Spórái elliptikusak, a domináns pozíciójuk centrális, méretük 0,5-0,7 • 1,0-1,5 mikron. A pálcikák jól láthatóan duzzadtak. A spórák egyik oldalán egy olyan rész (úgynevezett parasporális test) van, amely jól megfesthető kenu-alakban kristályibolyával és ugyanakkor hőálló tulajdonságú. A spórák nem festhetők meg saválló festékekkel. 2) Különböző táptalajokon a növekedés jellemzői A zselatinból álló kenettől eltekintve mindegyik inkubálást 37 °C-on hajtjuk végre. (1) Agar-agarból álló lemezen: A telepek színe opak, fakó, alakjuk kerek és szélük szabálytalan, barnásfehér. (2) Agar-agarból álló ferde tenyészeten: A növekedés szétterjedő és sokszorosodó a tenyészet felületén, ugyanakkor a telepek felülete opak és száraz. A tenyészet színe bamásfehér. (3) Folyékony táptalajon: A tenyészet teljes egészében zavarossá válik az inkubálás első napján. A második napon a felületen hártya kezd növekedni. A harmadik napon a hártya elfedi a felületet és a közeg tisztábbá válik, ugyanakkor a kísérleti kémcső fenekén micélium kicsapódása észlelhető. (4) Zselatinból álló keneten: Ha 20 °C-on inkubálást végzünk, az első napon a kenet hossza mentén szaporodás észlelhető. A második napon a szaporodó szakaszon depreszszió kezdődik. A közegben a zselatin közel a hatodik napon kezd elfolyósodni. Másrészt viszont ha az inkubálást 30 °C-on végezzük, akkor a második napon hártya kezd növekedni és a táptalaj a negyedik napon kezd elfolyósodni. A zselatin elfolyósodása a hetedik napon válik teljessé. (5) Bróm-krezolvöröst tartalmazó tejen: Az inkubálásnak közel az ötödik napjától kezdődően a bróm-krezolvörös kékké változik és közel a 12. naptól peptonizáció kezdődik. (6) Sabouraud-féle dextróztartalmú agar-agaron és Sabouraud-féle dextróztartalmú folyékony táptalajon: Sabouraud-féle agar-agarból (10 g peptonból, 40 g dextrózból, 15 g agar-agarból és 1000 ml ionmentesített vízből a pH beállítása nélkül állítjuk elő) álló ferde tenyészeten és Sabouraud-féle folyékony táptalajon (az előbbivel azonos összetételű, de agar-agart nem tartalmaz) 30 °C-on, illetve 37 °C- on a folyékony tenyészetben növekedés nem észlelhető, míg a ferde tenyészeten annak alsó részén gyenge növekedés tapasztalható. 3) Fiziológiai tulajdonságok Hacsak kifejezetten másképpen nem jelezzük, az inkubálási hőmérséklet 37 °C. (1) Nitrát redukálása 10 g hús-extraktumból, 10 g peptonból, 5 g nátrium-kloridból, 1 g kálium-nitrátból és 1000 ml ionmentesített vízből álló, 7,2-es pH-jú táptalajon az inkubálás első, harmadik és ötödik napján a tenyészet teljes mennyiségét vizsgálatnak vetjük alá nitrit kimutatása céljából. Az ötödik napon kifejezetten jelentkező reakció figyelhető meg és ha egy megfelélő reagenst adunk a tenyészethez, vörösesbarna csapadék válik ki. (2) Denitrifikációs reakció Ha a Komagata és munkatársai által leírt módszer (lásd: Hasegawa, T.: „Taxonomy and Identification of Microorganisms”, 223. oldal; a könyv a The University of Tokyo Press kiadó gondozásában 1975-ben jelent meg) szerint denitrifikációs reakcióra végzünk kísérletet, akkor az eredmény negatív. (3) Metilvörös-teszt 5 g glükózból, 7 g peptonból, 5 g nátrium-kloridból és 1000 ml ionmentesített vizből álló, 30 °C-on 7.5- es pH-jú táptalajon a tenyésztés első, második és ötödik napján metilvörös-tesztet végrehajtva mindannyiszor pozitív eredményt kapunk. (4) Voges-Proskauer teszt 5 g glükózból, 7 g peptonból, 5 g nátrium-kloridból és 1000 ml ionmentesített vízből álló, 30 °C-on 7.5- es pH-jú táptalajon a tenyésztés első, második és ötödik napján a Voges-Proskauer tesztet végrehajtva mindannyiszor negatív eredményt kapunk. (5) Indol képzése 20 g polipeptonból, 5 g nátrium-kloridból és 1000 ml ionmentesített vízből álló, 7,4-es pH-értékű táptalajon a tenyésztés első és második napján nem figyelhető meg, míg az ötödik napon megfigyelhető az indol képződése. (6) Hidrogén-szulfid képződése 3 g marhahús-extraktumból, 3 g élesztő-extraktumból, 15 g peptonból, 5 g proteóz-peptonból, 10 g laktózból, 10 g szacharózból, 1 g dextrózból, 0,2 g vas(II)-szulfátból, 5 g nátrium-kloridból, 0,3 g nátrium-tioszulfátból, 12 g agar-agarból és 0,024 g fenolvörösből desztillált vízzel. 1 litene feltöltés útján készült, 7,2-es pH-értékű táptalajon 7 napos inkubálás után sem észlelhető hidrogén-szulfid képződése. (7) Keményítő hidrolízise 0,2% oldható keményítőt tartalmazó agar-agarból készült lemezen végzett kenéses tenyésztés során jód-kálium-jodid rendszerrel végzett tesztelést hajtunk végre a tenyésztés első, második, harma5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
