188073. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-D-glükonsav előállítására
1 188 073 2 4. táblázat folytatása Koncentrációk 3 órai rázás után SHS-törzsek D-glükóz % inkubálás előtt 2-keto-D- 2,5-diketo-D- glukonsav % glukonsav % 2008 5,0 1,3 0,8 1,2 2009 5,2 1,9 0,7 1,3 2010 5,0 2,9 0,5 0,9 2011 5,0 2,8 0,7 0,9 4. Inkubálás nyers enzimkivonattal A 3. szakaszban leírt módon előállított keverékhez úgy adunk nyers enzimkivonatot, hogy a Folinmódszerrel mennyiségileg meghatározott protein koncentráció ml-enként 0,25 mg legyen. A keveréket az előbbiekben leírt módon rázzuk, majd 2 csepp 10 súly/térfogatszázalékos triklórecetsav oldatot adunk hozzá, hogy a proteint eltávolítsuk, majd szűrőpapíron kromatografáljuk. Az eredményeket az 5. táblázat tartalmazza. 5. táblázat Koncentrációk 3 órai rázás után Törzs SHS 2-keto-D- glukonsav (%) 2,5-diketo-D- glukonsav (%) 2003 1,0 1,0 2004 0,6 0,8 2005 0,4 0,4 2006 0,5 0,5 2007 0,3 0,4 2008 0,8 0,5 2009 0,4 0,6 2010 0,3 0,3 2011 0,3 0,3 A 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő, Erwinia nembe tartozó mikroorganizmusok izolálási módszerének folyamata Gyümölcs, zöldség vagy talaj-szuszpenzió (1-10 g/50 ml pepton-víz) i Sorozathigitás i Agár lemez felületén megfelelő hígításban szélesztés (A közeg) i Inkubálás 28 'C-on 38 vagy 72 óra hosszat ■ i , A világos zónával körülvett telepek azonosítása a közegben kalcium-karbonátot oldva .1 Az azonosított telepeknek steril tűvel való kiemelése és ferde tenyészetre való átoltása (B közeg) i Inkubálás 28 °C-on 16-24 óra hosszat i 1-3 mm széles foltok rétegezése szelekciós agar lemezekre (C közeg) i Inkubálás 28 °C-on 48-72 óra hosszat 1 Tenyészetük körül világos zónát mutató törzsek azonosítása és az azonosított törzsek ferde tenyészetéből származó törzsek sejtjeinek átoltása 8 ml _ D közeget tartalmazó nagy kémcsövekbe 5 i Inkubálás 28 “C-on 24 óra hosszat a kémcsövet rázva (199/perc, amplitúdó 2 cm) i Termékek papírkromatográfiás analízise 10 i A megfelelő 2,5-diketo-D-glukonsav termelőket kiválasztjuk, majd az elsődleges ferde tenyészetről D közeget tartalmazó, frissen készített ferde tenyé, r szetekre juttatjuk 15 i Inkubálás 28 °C-on 24 óra hosszat 1 Egy kacsnyi frissen készült ferde tenyészetet átol- 20 tunk nagy kémcsövekben lévő F közeget tartalmazó táptalajra 1 Inkubálás 28 °C-on 10-14 óra hosszat rázás közben (199/perc; amplitúdó: 2 cm) „ 1 „ 0 A 2,5-diketo-D-glukonsav termelők második kiválasztása 5 ml tenyészettel beoltott 50 ml fermentációs táptalajt (G közeg) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 30 Inkubálás 28 “C-on 48 óra hosszat forgó rázógépen (270/perc, amplitúdó: 7 cm) 1 2,5-diketo-D-glukonsav és más termékek azonosítása papírkromatográfiával 35 I A papírkromatográfiás analízis alapján az eredményes 2,5-diketo-D-glukonsav termelők kiválasztása. 40 A 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő mikroorganizmusok kiválasztásához alkalmazott táptalajok összetétele (g/liter) 45 Alkotórész A B C D E F G glükóz glicerin mannit 20 5 150 100 25 10 200 élesztőkivo-50 nat (Difco) polipepton 1 2 3 (Daigo) kukoricalek-15 10 50 30 vár 55 kálium-dihidrogén-foszfát 1 1 1 1 1 1 kristályos magnéziumszulfát 0,2 0,2 0,5 0,5 0,2 nátriumklorid 1 60 kalciumkarbonát 7 43,5 29 5 63 agar 20 20 20 PH 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 A pH-t a külön sterilizált kalcium-karbonát hoz- 65 záadása előtt állítottuk be. 10
