187836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amino-propil)-amino-bleomicin származékok előállítására
1 187 836 2 A károsodás gyakorisága A súlyosság foka sorszáma tüdöfibrosisban szenvedő egerek száma (%) A tüdőfibrosis pontszámértéke, Arány osztva az állatok Arány összes számával (%) 19. 1/9 (11) 0,18 1/27 (4) 0,05 20. 1/9 ÓD 0,18 1/27 (4) 0,05 22. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 27. 1/5 (20) 0,32 1/15 (7) 0,08 32. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 34. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 35. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 38. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 39. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 41. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) (0) 42. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 43. 0,9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 44. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 45. ■ 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 46. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 47 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 48. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 49. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 50. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 51. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 52. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 53. 0/9 (0) 0,00 0/27 (0) 0,00 APMP 9/9 (100) 1,6 48/27 (178) 2,15 (4) Az akut toxicitás vizsgálata Több találmány szerinti vegyület LDS0 értékét mértük 10 egymást követő napon át való adagolással. 1. Kísérleti módszer CDFj/SLC törzsű, 6 hetes him egereket (csoportonként 7 állatot) szubkután úton kezeltünk a találmány szerinti vegyületekkel, minden egyes vegyület esetében különböző dózist adagoltunk. Az LDS0 értéket (napi dózis) az adagolási időszak alatti elhullásból számítottuk a Behrens-Kärber módszer segítségével. 2. Kísérleti eredmények Eredményeinket az 5. táblázat tartalmazza. A fentebb részletezett biológiai sajátságok alapján nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületeknek daganatgátló hatása van, és mellékhatásaik - például tüdőkárosító hatásuk - lényegesen csökkent. Várható tehát, hogy a találmány szerinti vegyületek hasznos rákellenes hatóanyagok, melyek 5. Táblázat A vegyület sorszáma betűjelzése LDS0 mg/kg/nap 32. MCU 17,5 34. MDDBZOBZ 60,0 37. EEDBZ 50,0 43. PYDBZ 12,5 Bleomicin-komplex' 20 mellékhatásai csekélyek. Rákbetegség kezelésének céljára a vegyületek különböző dózisformákban adagolhatok, így például -szilárd készítmény, kenőcs és oldatok, elsősorban azonban injekció formájában. Az adagolás módja: hetenként 1 5 alkalommal, a dózis hetenként 5-200 mg. A találmány szerinti eljárást részletesen ismertetjük az alábbi példákban, melyek nem korlátozó 5 jellegűek. 1. példa 10 A) lépés: 1,0 g 3-{N-metil-N-(3'-amino-propil)-aminojpropil-amino-bleomicin-trihidrokloridot (ré/.tartalmú forma) 30 ml metanolban oldunk, és hozzáadunk előbb 227 mg cikloundekánkarbaldehidet, 15 majd 26 mg nátrium-cián-bórhidridet, az. elegyet szobahőmérsékleten 16 órán át állni hagyjuk, ezután a reakciókeverék pH értékét 6n sósavval 1,0- ra állítjuk, és 10 percig állni hagyjuk a reakció befejezése végett. Ezt követően In nátrium-hidro- 20 xid oldattal közömbösítjük, és a metanolt vákuumban ledesztilláljuk. A maradékot desztillált vízzel 50 ml-re töltjük, és éterrel extraháljuk az aldehid fölöslegének eltávolítása végett. A vizes réteget 100 ml Amberlite® XAD-2 (Rohm and Haas Co.) 25 gyantával töltött oszlopon vezetjük át, 4%-os vizes ammónium-acetát oldat és 2%-os vizes ecetsavoldat 1 : 1 térf./térf. arányú keverékében, ennek során a termék a gyantán megkötődik. Az adszorbeált fázist a lineáris koncentrációs gradiens eljárásá- 30 val eluáljuk: ehhez 500 ml fenti pufferoldatot használunk, melyhez folyamatosan 500 ml metanolt adagolunk. Az összesen 200 ml térfogatú frakciókat - melyeket körülbelül 65%-os metanolkcncentrációval eluáltunk, és amelyek abszorpciós 35 maximuma 290 mg-nél van - összegyűjtjük. E frakciókat egyesítjük, a metanolt vákuumban ledesztilláljuk, és az így kapott vizes oldatot 100 ml Amberlite® XAD-2 gyantával töltött oszlopra visszük. A termék a gyantán megkötődik. Ezután 40 a7 oszlopot 150 ml desztillált vízzel átmossuk, majd a kívánt terméket 1/50 mólos vizes sósavoldat és metanol 1 : 4 térf./térf. arányú elegyével eluáljuk. A bleomicinszármazékot tartalmazó, kék színű frakciókat összegyűjtjük, Dowex* 44 OH-típusú 4S aaioncserélő gyantával (Dow Chemical Co.) közömbösítjük, vákuumban betöményítjük és liofiliz áljuk. Az így kapott liofilizált port 10 ml desztillált vízben oldva feivisszük egy 100 ml térfogatú, CM- 50 Sephadex® C-25 Na+-típusú gyantával (Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött oszlopra, melyet előzőleg 1 : 20 mólos ecetsavból és nátrium-acetátból készült pufferral 4,5 pH-ra egyensúlyoztunk, ekkor a kívánt termék az oszlopon megkötődik. Az 55 eluálást a lineáris koncentrációs gradiens módszerével végezzük úgy, hogy az előbb említett pufferoldathoz folyamatosan nátrium-klorid oldatot adunk, és így a nátrium-klorid koncentrációját 1,0 mólra növeljük. Összesen 550 ml eluálószert veze- 60 tünk át az oszlopon, és összesen 120 ml kék színű *rakciót gyűjtünk össze körülbelül 0,65 mól nátrium-klorid koncentráció mellett. Az összegyűjtött frakciókat Amberlite®;XAD-2 gyantával sómentesítjük, és liofilizáljuk. így 872 mg (790o) hozammal 65 jutunk a réztartalmú 3-[N-metil-N-/3'-(ciklounde-9
