187836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amino-propil)-amino-bleomicin származékok előállítására
1 187 836 2 sómentesítjük úgy, hogy átvezetjük egy adszorbeáló gyantával - ilyen például az Amberlite® XAD-2 (Rohm and Haas Co. gyártmánya) - töltött oszlopon, desztillált vízben, ennek során a kívánt termék a gyantára adszorbeálódik. Ezután az oszlopot desztillált vízzel mosva eltávolítjuk a sót, az adszorbeált fázist pedig eluáljuk savas-vizes metanollal, például 1/50 n vizes sósav és metanol 1 : 4 térf./térÉ elegyével, és összegyűjtjük az eluátum azon frakcióit, melyek a kék színű bleomicinszármazékot tartalmazzák. Egyesítés után az oldatot közömbösítjük - amennyiben szükséges, Dowex® 44 (OH-típusú anioncserélő gyanta, a Dow Chemical Co. készítménye) segítségével -, majd vákuumban betöményítjük és liofilizáljuk. így nyers, kék por formájában kapjuk a kívánt terméket. További tisztítás végett a nyersterméket a következőként kezeljük. A nyers, porszerű terméket desztillált vízben oldva CM-Sephadex® C-25 (Na+ tipus, Pharmacia Fine Chemicals Co. gyártmánya) oszlopon vezetjük át, melyet előzőleg 1 /20 mólos, 4,5 pH értékű ecetsav- nátrium-acetát pufferoldattal kiegyensúlyoztunk, ennek során a kívánt termék a gyantára adszorbeálódik. A megkötött fázist ezután a lineárisan növekvő koncentrációs gradiens nódszerével eluáljuk: ezt úgy végezzük, hogy a fenti pufferoldathoz folyamatosan nátrium-kloridot adunk és így a nátrium-klorid koncentrációját fokozatosan 1,0 mólra növeljük. Ha úgy találjuk, hogy az eluátumnak a kívánt terméket tartalmazó frakciói még mindig tartalmaznak szennyezéseket, akkor a fentebb említett kromatografálást egy második kromatográfiával követjük, melynek során például Amberlite® XAD-2 gyantát alkalmazunk. Ezt úgy végezzük, hogy a nyersterméket desztillált vízben való oldás után vezetjük át a gyantán - melyet pufferoldatban, például 4%-os vizes ammóniumacetát oldatban töltünk az oszlopba - s így a kívánt terméket a gyantára adszorbeáljuk, és ezt követően az adszorbeált fázist a lineáris koncentráció-gradiens módszerével eluáljuk. Ezt végezhetjük például úgy, hogy a pufferoldathoz folyamatosan metanolt adunk, a metanol koncentrációjának fokozatos növelése végett. Ebben az esetben az eluálás úgy zajlik le, hogy először a kiinduló anyagok eluálódnak, ezt követi az az (I) képletű vegyület, melyben R4 jelentése hidrogénatom, és utoljára eluálódik az a származék, amelyben R3 és R4 azonos csoportot jelentenek. A frakciók elkülönítése az ibolyántúli fényelnyelés megfigyelésével lehetséges. Ha a kívánt terméket tartalmazó frakció még mindig nem teljesen tiszta, akkor a fent leírt kromatográfiás eljárást meg kell ismételni. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és a metanolt vákuumban ledesztilláljuk, majd sómentesítést végzünk Amberlite ® XAD-2 segítségével, és az igy kapott oldatot liofilizáljuk. így amorf, kék színű por formájában kapjuk a réztartalmú (amino-propil)-amino-bleomicin-származékot. A rézmentes formát úgy készítjük, hogy a réztartalmú alakból a rézatomot ismert módszerrel - például etilén-diamino-tetra-acetát (EDTA) segítségével (31 875/77. számú közzétett japán szabadalmi bejelentés; 3 929 993. számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) - eltávolítjuk. Az alábbiakban leírjuk a réz eltávolításának egyik módját. A réztartalmú terméket desztillált vízben oldjuk, és az oldatot Amberlite® XAD-2 gyantával töltött oszlopon vezetjük át. Ekkor a termék adszorbeálódik. Az oszlopot olyan vizes oldattal mossuk, mely nátrium-kloridot és 5% etilén-diamin-tetraecetsavdinátriumsót (rövidítése: EDTA.2Na) tartalmaz. Ekkor a réziont az EDTA.2Na kimossa, és a gyantán adszorbeált állapotban marad a rézmentes (amino-propil)-amino-bleomicin-származék. Ezután a gyantát nátrium-klorid oldattal mossuk az EDTA.2Na eltávolítása végett, majd vízzel mossuk, és végül savas-vizes metanollal - például 1 /50 n vizes sósavoldat és metanol 1 : 4 térf./térf. arányú keverékével - eluáljuk, és összegyűjtjük azokat a frakciókat, melyek 290 mp hullámhosszon elnyelési maximumot mutatnak. E frakciókat egyesítjük,- és 6,0 pH-ra állítjuk Dowex® 44 (OH-típus, a Dow Chemical Co. gyártmánya) gyanta segítségével, utána vákuumban betöményítjük, majd liofilizáljuk. így a kívánt (amino-propil)-amino-bleomicinszármazék rézmentes alakjának hidrokloridját kapjuk fehér, amorf por formájában. Ha a vizes sósav helyett vizes kénsavoldatot használunk, akkor a szulfátot kapjuk. így tehát a kívánt sót nyerhetjük úgy, hogy az eluálás lépésében a megfelelő savat használjuk. Hí az így késztett (amino-propil)-amino-bleomicin-származékot 6 n vizes sósavoldattal 105 °C hőmérsékleten 20 órán át hidrolizáljuk, akkor - az aminovegyületeken kívül - a bleomicinek közös bomlástermékei képződnek: L-treonin, ß-amino-ß(4-amino-5-metil-6-karboxi-2-pirimidinil)-propionsav, 2-metil-3-hidroxi-4-amino-n-pentánsav, ß-hidroxi-L-hisztidin, ß-amino-L-alanin és 2'-(2- amino-etil)-2,4'-bitiazol-4-karbonsav. Másrészt, ha az (amino-propil)-amino-bleomicin-származékot Amberlist 15 jelenlétében metanolízisnek vetjük alá, akkor - ugyanúgy, mint a bleomicin esetében - L-glukózt és 3-0-karbamoil-D-mannóz-(metilglukozid)-ot kapunk, amint ez gázkromatográfiás után kimutatható. E tények igazolják, hogy a találmány szerinti eljárással készült (amino-propil)amino-bleomicin-származékok szerkezete megfelel az (I) általános képletnek. A találmány szerinti bleomicinszármazékok előállítása céljából kiinduló anyagként alkalmazott (II) általános képletű vegyületek példáiként a következő vegyületeket említhetjük: (1) 3-(N-(3-amino-propil)-amino)-propil-amino-bleomicin, (APP); (2) 3-(N-(3-amino-propil)-N-metil-amino)-propil-amino-bleomicin (APMP), (3) 3-(N-(3-amino-propil)-N,N-dimetil-amino)-propil-amino-bleomicin (MMHH), (4) 3-(N-(3-amino-propil)-N,N-dietil-amino)-propil-amino-bleomicin (EEHH), (5) 3-(N-(3-amino-propil)-N,N-dibutil-amino)-propil-amino-bleomicin (BBHH), (6) 3-{N-[3'-(N'-(3-amino-propil)-N', N'-dimetil-amino)-propil]-N,N-dimetil-amino)-propil-amino-bleomicin (PP4M), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
