187835. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)-N-helyettesített bleomicinek és savaddiciós sóik előállítására
1 187 835 2 dós maximumot mutató frakdókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciókat Dowex® 44-gyel semlegesítjük (a Dow Chemical Co. hidroxil-típusú anioncserélő gyantája), majd csökkentett nyomáson bepároljuk és liofilizáljuk. A származékot nyers por formájában nyerjük. Egyes esetekben a sómentesítési lépés elhagyható és a desztillált vízben oldott csapadékot közvetlenül az eljárás második lépésébe vihetjük. A második lépésben a nyers por desztillált vizes oldatát pH 4,5-ös 1/20 mol/1 ecetsav-nátriumacetát pufferral ekvilibrált, nátrium formájú CMSephadex ® C-25-tel (Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött oszlopon engedjük át, a kívánt termék adszorbeálódik az oszlopon. Ezután az adszorbeált anyagot lineáris koncentrációgradiens eljárással eluáljuk, a koncentrációgradienst úgy hozzuk létre, hogy az előbbiekben megadott pufferhez folyamatosan nátrium-kloridot adunk, míg ez utóbbi koncentrációja fokozatosan eléri az 1,0 mól/1 értéket. Ebben a lépésben az el nem reagált reagensek és a melléktermékek a kezdeti szakaszban eluálódnak és ultraibolya abszorpciós segítségével elkülöníthetők. Ha a kívánt terméket tartalmazó frakciót szennyezettnek találjuk, a kromatografálást a szennyezések eltávolítására megismételjük. Alternatív megoldásként az előzőekben ismertetett kromatográfiás eljárás helyett más kromatográfiás tisztítási eljárást is alkalmazhatunk, például használhatunk Amberlite® XAD-2 adszorptív gyantát. A nyers termék vizes oldatát a pufferes, például 1%-os vizes ammónium-acetát-oldatos gyantával töltött oszlopon engedjük át, a kívánt termék a gyantán adszorbeálódik. Az adszorbeált anyagot lineáris koncentráció gradiens eljárással eluáljuk, a pufferhez folyamatosan metil-alkoholt adunk, úgy, hogy a pufferben növekvő metil-alkohol koncentráció legyen. Mivel a reagálatlan reagensek a kezdeti szakaszban eluálódnak, a melléktermék nagy része pedig később, ezek a terméktől ultraibolya abszorpciós ellenőrzés segítségével elkülöníthetők. Ha a kívánt frakciót szennyezettnek találjuk, a szennyezéseket ismételt kromatografálással teljesen eltávolíthatjuk. A két ismertetett kromatográfiás eljárás különkülön alkalmazható vagy egymással kombinálhatok. A kívánt terméket tartalmazó tisztított frakciót adszorpciós gyantával, például Amberlite® XAD-2-vel sómentesítjük és liofilizáljuk, a réztartalmú (amido)-N-helyettesített bleomicint kék, amorf por formájában kapjuk. A rézmentes formát a réztartalmú formából a réznek valamely ismert eljárással, például a 31875./ 77. számú japán szabadalmi leírásban ismertetett módon etilén-diamin-tetraacetát alkalmazásával, nyerjük. Az alábbiakban a réz eltávolítását bemutató példát ismertetünk. A réztartalmú terméket desztillált vízben oldjuk, az oldatot desztillált vizes Amberlite® XAI>-2-vel töltött oszlopon engedjük át, a réztartalmú termék a gyantán adszorbeálódik. Ezután a gyantát nátrium-kloridot és 5% etilén-diamin-tetraacetát-dinátrium-sót (EDTA.2 Na) tartalmazó vizes oldattal mossuk, az EDTA.2 Na-tal a rézionokat eltávolítjuk, így a gyantán adszorbeálva a rézmentes (amido)-N-helyettesített bleomicin marad vissza. Ezt követően a gyantát az EDTA.2 Na eltávolítására nátrium-klorid-oldattal majd desztillált vízzel mossuk, végül savas vizes metanollal, például 1/50 n vizes hidrogén-klorid és metilalkohol 1- : 4 térfogatarányú elegyével eluáljuk, a 290 mp körül abszorpciós maximumot mutató frakciókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciók pH-ját hidroxil-formájú Dowex® 44-gyel (Dow Chemical Co.) 6,0 értékre állítjuk, csökkentett nyomáson bepároljuk és liofilizáljuk. Rézmentes (amido)-N-helyettesített bleomicin sósavas sót nyerünk fehér amorf por formájában. Ha a nátrium-klorid és a vizes hidrogén-kloridoldat helyett nátrium-szulfátot és vizes kénsavat használunk, a vegyületet szulfátsója formájában nyerjük. Ehhez hasonlóan a vegyület bármely kívánt sója formájában előállíthatjuk az eluciós lépésben alkalmazott só és sav alkalmas megválasztásával. Ilyen módon nyert sók például a sósavas són és a szulfátsón kívül az acetát-, tartarát-, citrát-, maleát- és laktátsók. Ha az előzőekben ismertetett eljárással előállított (amido)-N-helyettesített bleomicineket 6 n hidrogén-kloriddal 105 °C hőmérsékleten 20 órán át hidrolizáljuk, az R—H általános képletű aminon és az X—NH2 általános képletű aminon vagy az említett aminok bomlástermékein kívül egyes esetekben a bleomicinekre jellemző bomlástermékeket, például L-treonint, ß-amino-ß-(4-amino-6-karboxi-5- metil-pirimidin-2-il)-propionsavat, 4-amino-3- hidroxi-2-metil-n-pentánsavat, ß-hidroxi-L-histidint, ß-amino-L-alanint és 2'-(2-amino-etil)-2,4'bitiazol-4-karbonsavat is detektálunk. Ez a tény alátámasztja azt az állítást, hogy az (amido)-N- helyettesített bleomicinek kémiai szerkezete az előzőekben ismertetett (I) általános képletnek megfelelő. Ha a kiindulási anyagként használt (VI) általános képletű vegyületekben X0 jelentése hidroxilcsoport és R0 jelentése bleomicin terminális aminosav maradéka, (Via) általános képletű - réztartalmú - dezamidobleotr.icineket nyerünk, a képletben BM és R jelentése az előzőekben megadott. A vegyíiletek előállítására (II) általános képletű rézmentes bleomicineket hidrolizálunk patkányból származó vagy marha- vagy sertésmájból kivont inaktiváló enzimmel. Például marhamájat foszfátpufferben homogenizálunk, 8000 fordulatszámmal .lecentrifugáljuk. A felülúszót foszfát pufferrel szemben dializáljuk, így nyers enzimoldatot nyerünk. Ehhez az enzimoldathoz adjuk hozzá a bleomicinek foszfátpufferes oldatát. Az elegyet 37 °C hőmérsékleten 5—48 órán át reagáltatjuk, majd a reakcóelegyet megfelelő módszerrel elkülönítjük a fehérjétől. [A fehérjét eltávolíthatjuk például 5%-os triklór-ecetsav-oldattal (TCA) történő kicsapással, a csapadék centrifugálással való elkülönítésével, majd a csapadék 5”0- os TCA-oldattal való háromszori kimosásával, a mosófolyadékot összegyűjtjük.] A fehérjementes elegyet semlegesítjük, a termék réz-keláttá alakítására feleslegben lévő réz-acetáttal keverjük össze. Ezt követően sómentesítés céljából a réz-kelátot desztillált vizes Dowex® HP 40 adszorpciós gyantával töltött oszlopon engedjük át, a gyanta a kívánt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
