187835. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)-N-helyettesített bleomicinek és savaddiciós sóik előállítására
1 ,187 835 2 Vegyület sorszáma Röviditett név Előfordulás Mérték Tüdőfibrózisban sz.envedő egerek száma (%) Tüdőfibrózis összes pontszáma/az összes minta száma i/o) Arány 52. dMMDBZ-PEP 0/9 (0) 0/27 (0) 0 53. dMMDBZ-OCT 0/9 (0) 0/27 (0) 0 54. dMMDBZ-BPA 0/9 (0) 0/27 (0) 0 55. dEEDBZ-PEP 0/9 (0) 0/27 (0) 0 56. dEEDBZ-OCT 0/9 (0) 0/27 (0) 0 57. dEEDBZ-BPA 0/9 (0) 0/27 (0) 0 58. dMCO-BPA 0/9 (0) 0/27 (0) 0 59. dMCO-OCT 0/9 (0) 0/27 (0) 0 60. dMCO-PEP 0/9 (0) 0/27 (0) 0 62. dMCNBZ-OCT 0/9 (0) 0/27 (0) 0 64. dMDDBZOBZ-PEP 0/9 (0) 0/27 (0) 0 65. dMDDBZOBZ-OCT 0/9 (0) 0/27 (0) 0 5. LD50 érték egérben, 10 egymást követő napon való adagolással meghatározva 7 tagú, 6 hetes hím CDF/SLC törzsbe tartozó egércsoport tagjainak 10 egymást követő napon naponta egyszer szubkután injekció formájában különböző dózisokban bleomicin származékokat adtunk be. Az adagolás ideje alatti mortalitás alap- 30 ján Behrens-Kärber módszerrel meghatároztuk az LD50 (napi dózis) értéket. Az eredményeket az 5. táblázatban ismertetjük. 5. Táblázat 35 Vegyület sorszáma Név rövidítése LD50 10 egymást követő napon való adagolás alatt mg/kg/nap 52. dMMDBZ-PEP 13,9 53. dMMDBZ-OCT 15,0 64. dMDDBZOBZ-PEP >81,4 65. dMDDBZOBZ-OCT >75,7 Amint az előzőekből nyilvánvaló a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek ellenállóak bleomicin inaktiváló enzimmel szemben, tenyésztett HeLa sejtekkel szemben jelentős növekedésgátló hatással és megkülönböztetett antimikróbás 50 aktivitással bírnak, tüdőre kifejtett toxicitásuk igen kis mértékű, e tulajdonságokkal klinikai alkalmazhatóságuk alátámasztható. Gyógyszerként való alkalmazás céljára a találmány szerint előállított vegyületeket szokásos mó- 55 don hordozó- és/vagy kötőanyaggal keverjük és injekció, tabletta, kenőcs, kúp, stb. formájában szereljük ki. Hordozó- és/vagy kötőanyagként vizet, cukrokat - például mannitot - és egyéb, gyógyászati készítmények előállítására szokásosan al- so kalmazott anyagokat használunk. Az alkalmazott dózis ugyan az adagolás módjától függő, általában hetente 1-4-szeri adagolás esetén 2-10 mg egyszeri dózis adható, a heti teljes dózis pedig 2-200 mg/személy/hét lehet. 55 A következőkben a találmányt példákban mutatjuk be, a példák nem korlátozó jellegűek. 1. példa A lépés 200 g súlyú friss marhamájat 400 ml pH 7,2-es 0,05 mol/1 foszfátpufferben homogenizálunk, majd 8000 fordulatszámon 30 percig centrifugáljuk. A felülúszót 0,05 mol/1 -es foszfátpufferrel szemben dializáljuk, így nyers enzimoldatot nyerünk. 10 g bleomicin B2-höz 400 ml nyers enzimoldatot adunk. Az elegyet 37 °C-on 24 órán át reagáltatjuk. Ezután a reakcióelegyhez 40 ml 55%-os triklórecetsav-oldatot (TCA) adunk, mellyel a fehérjét lecsapjuk. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk, majd 5%-os TCA-oldattal háromszor mossuk. A felülúszót és a mosófolyadékokat egyesítjük, 4 mol/l-es nátrium-hidroxid-oldattal semlegesítjük és 3,2 g réz-acetátot keverünk hozzá - ez bleomicinre számítva 2,4 mólekvivalens - így a kívánt termék réz-kelátját képezzük. Sómentesítés céljából a kapott réz-kelátot 1 liter térfogatú, desztillált vizes Diaion® HP 40 adszorpciós gyantával (Mitsubishi Chemical Co.) töltött oszlopon engedjük át, a kívánt termék az oszlopon adszorbeálódik. A sókat az oszlopról 1,5 1 vízzel kimossuk, majd az adszorbeált anyagot 1/50 n vizes hidrogén-klorid-oldat és metanol 1 :4 térfogatarányú elegyével eluáljuk, a 290 mp körül abszorpciós maximumot adó frakciókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciókat hidroxil-típusú Dowex® 44 (Dow Chemical Co.) gyantával semlegesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A koncentrátumot 1 liter térfogatú, nátrium-típusú, CM-Sephadex® C-25 gyantával (Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött, pH 4,5, 1/20 mol/1 ecetsav - nátrium-acetát púderrel ekvilibrált oszlopra visszük, melyen az anyag adszorbeálódik. Az adszorbeált fázist lineáris koncentráció-gfadienssel eluáljuk, melyet nátrium-klorid koncentrációjának az előzőekben megadott pufferben 1,0 14
