187709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes antigén preparátum és vakcina előállítására
1 .187 709 2 Az eredmények azt mutatják, hogy a nagyobb antitest mennyiséggel kezelt csoport fertőzés elleni védelme hatásosabb volt. A kontrol csoporthoz tartozó egerek mind elpusztultak a fertőzés utáni 8. napon belül. A 25.1 antigénnel immunizált egerek mind túlélték a fertőzést. A zárójelben levő adatok jelentése „Kevesebb mint”. (A 2. táblázat adatait grafikusan az 1. ábrán mutatjuk be.) Az immunizált egerekből vett szérum antigén specifikusságát immunprecipitációval ellenőriztük és az eredmény azt mutatta, hogy az antitest választ az immunizációhoz használt 230 000-es molekulasúlyú schizonta antigén ellen és ennek degradációs töredékei ellen irányult. 7. példa: A Plasmodium falciparumból származó antigén azonosítása Percoll rétegen keresztül történő centrifugálással előállított Plasmodium falciparummal fertőzött erythrocyták schizontában dús frakcióját 33S-metioninnal jelöltük' 2 órás periódus alatt. A sejteket összegyűjtöttük és a 2. példányban leírtak szerint 4 “C-on lízissel szolubilizáltuk. Centrifugálás után a felülúszó réteget használtuk immunprecipitálás céljaira egy antitesttel, mely az 1. példa szerinti hybridómából származott, és amely a Plasmodium falcipárumra specifikus. A specifikus csapadékot SDS gél elektroforézisnek vetettük alá és az antigén egy 1,95 x 105 molekulasúlyú anyagként viselkedett. Emellett számos diszkrét degradációs terméket is megfigyeltünk. A főbb hasadványok molekulasúlya 1,53 x , 1,50 x és0,83xl05 volt, és ezen kívül kisebb, 1,12 x, 1,1 x és 1,08 x 105 molekulasúlyú hasadványok is jelen voltak. Az 1,95x10s molekulasúlyú primer fehérje azonosítása, melyből a specifikus töredékek később származtak, úgy történt, hogy 20 perces periódus alatt megjelöltük a sejteket. Ezen anyag extraktumaiból, Plasmodium falciparum antitest használatával készült immuncsapadékok az összes 35S-metionin jelölőanyagot az 1,9 x 105 molekulasúlyú antigénben tartalmazták. Az immunlecsapás és SDS gél elektroforézis szerint ez az antigén (és ennek specifikus töredékei) erősen jellemző arra az anyagra, melyet a Plasmodium falciparumhoz használt humán immun szérum felismer. A nagyobb töredékekre, valamint az 1,95 x 105 molekulasúlyú mitára vonatkozó aminosav szekvenciát a 355-metionin-tartalmú paptidek pepiid térképezésével állapítottuk meg. Az antigén és töredékeinek izoelektromos pontját meghatározva közelítőleg az alábbiakat kaptuk: 5,8 (1,95 x10s), 5,2 (1,53 x és 1,50 x 105), 6,0 (1,1 x 10s) és 6,2-6,5 (0,83 x 10s). 8. példa: Antigén előállítása Plasmodium falciparumból Emberi erythrocyta kultúrán tenyésztett Plasmodium falciparum parazitákat szolubilizáltunk a 2. példában leírtak szerint.A szolubilizált anyagot WIC 89.1 hybridoma vonalat tartalmazó egér ascites folyadékából nyert immunglobulinnal párosított Sepharose oszlopon áthajtottuk. Amikor az oszlopot kimostuk és a 2. példában leírt 50 mmól dietilamin, 0,1 % NP40 tartalmú, 11,5 pH-jú oldatta' eluáltuk, az eluátum főleg az 1,95 x 10s molekulasúlyú antigént és a 0,83 x 105 molekulasúlyú töredéket tartalmazott. 9. példa: Plasmodium falciparumból származó antigén szintézise és előállítása A paraziták sejten belüli fejlődése alatt képződött fehérje szintézisét és képződését 48 órás ciklusidő alatt tanulmányoztuk egy in vitro Plasmodium falciparum kultúrában, melyet 33 órás időközönként két szorbit (10%-os szorbitoldat, elbontja az érett parazitákat tartalmazó sejteket) kezeléssel szinkronizáltunk. A fejlődés stádiumát Giemsafestékkel jelölt paraziták morfológiai vizsgálatával követtük 3 óránként a második szorbit kezelés után. Az első 12 órában csak gyűrű képződés volt megfigyelhető, de ezután trophozoitok kezdtek megjelenni, és legnagyobb számban a 24. órában voltak jelen. Schizontákat a 27. órában figyeltünk meg először, és a 37. órában már ezek domináltak. A 39. órában kevés számú új gyűrű forma volt Iá.ható, jelezve, hogy néhány merozoit felszabadult, bár a gyűrű formák többsége csak a 35—48. óránál jelent meg. Hat óránként megvizsgáltuk a 30 percig 35S- metioninnal szintetizált polipeptideket. A fehérjeszintézis maximuma a schizogonia alatt volt a 36. órában. Sok fehérje szintézise a fejlődési ciklus ideje-e korlátozódott. Az egyik legnagyobb mennyiségben előforduló fehérje, az 1,95 x 105 molekulasúlyú fehérje csak a schizogonia alatt képződött. A fehérje képződésekor mindig végeztünk immunprecipitálást összegyűjtött humán immun szérummal. Világos képet figyeltünk meg. A gyűrű- és a trophozoit-fázis alatt csak két polipeptid, az 1.6 x 105 és a 0,71 x 105 molekulasúlyú volt az, amelyet a humán immun szérum felismert és lecsapott. A schizogenia alatt számos polipeptidet ismert fel a humán immun szérum. A leggyakrabban előforduló fajták molekulasúlyai (a 0,3xl05-nél nagyobbak) a következők voltak: 0,37x, 0.4x, 0,46 x, 0,62 x, 0,72 x, 0,80 x, 0.84 x , 0.89x. 1,04 x, 1,20 x, 1,34 x, 1,46 x (düblet), 1,78 x, 1,95 x , 2,08 x , 2,20 x és 2,35 x 105. A fenti fehérjék közül néhány a schizogonia alatt, egy bizonyos adott időben képződött. A 89.1 monoklón antitest tehát mindig lecsapta az 1,95 x 105 molekulasúlyú fehérjét a schizogonia folyamán. A szintézist követően a fehérje alakulását immunprecipitációval vizsgáltuk, amihez a szolubilizált, radioaktív úton jelölt anyagot és a sejtekből nyert, ugyancsak szolubilizált anyagot használtuk, melyet előzőleg radioaktív úton jelöltünk majd lecseréltük jelzetlen metioninnal 60 vagy 120 percig. A paraziták fejlődési ciklusának 30. órájában (éretlen schizonták) a 120 perces lecserélés a jelölésben nem eredményezett lényeges eltolódást az ala5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
