187421. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az Aujeszky-féle betegség elleni inaktivált, adjuvált oltóanyag előállítására
1 2 . 187 42l: 10 20 25 tiváljuk és olajos inkomplett adjuvánssal adjuváljuk. A találmány szerint előállított vakcina kiváló immunizáló hatása több tényezőre vezethető viszsza. A felhasznált vírustörzs egy hazai járványesetből származik, biológiai tulajdonságaira jellemző az eredményes szaporíthatóság, sejttenyészetben és fogékony állatban egyaránt, valamint a magas infektív titer, a jó immunizálóképesség. Az utóbbi megőrzésében a protektiv antigéneket kímélő inaktiválási eljárásnak fontos szerepe van. összehasonlító inaktiváláskinetikai vizsgálatok során választottuk ki ismert anyagok közül ázt az inaktiválószert, annak koncentrációját, az inaktiválási eljárás hőmérséklet- és idő paramétereit, amely a haté- 15 konysági vizsgálat során a legjobb eredményt adta. Az inaktiválásra előnyösen használt etilénimint az általunk kifejlesztett eljárás alapján híg vizes, így veszélytelen oldat formájában felhasználás előtt ciklizáljuk. Az inaktivált vírusanyagot olajos inkomplett adjuvánssal adjuváljuk. Előnyösen az általunk kifejlesztett „phylaxia” adjuvánst alkalmazzuk, amely 73% Marcol 52 olaj (ESSO), 12% Span 80 (Atlas), 3% Span 20 (Atlas) és 12% Tween 60 (Atlas) keveréke. A szövettenyészet kialakítására a szokásos Roux palackokat alkalmazhatjuk, de előnyösen laboratóriumi forgató torony (Gyártó: Elektromos Fémipari és Szolgáltató Szövetkezet) vagyis rolling be- 30 rendezés alkalmazásával készítjük a szövettenyészetet, mert ez nagyon gazdaságos. A rolling berendezés egyrétegű sejttenyészetek előállítására szolgáló, lassan forgó elektromos meghajtású készülék. A tenyészedények (csövek vagy henger formájú 35 palackok) a készülék állványára helyezve hosszanti tengelyük mentén 10-15 perc'1 fordulatszámmal forognak. A sejttenyészet beindításakor a bevitt sejtek az edény falán körben megtapadnak, és szaporodásuk következtében a henger felületét teljesen 40 benövik. A lassan mozgó tápfolyadék a sejtek felületéről eltávolítja az anyagcseretermékeket, így jobb szaporodási feltételek alakulnak ki, mint az állandó helyzetű kultúra esetén. Míg egy hagyományos Roux palack hasznos felülete mintegy 45 300 cm2, addig a rolling palack használható felülete 650-660 cm2, ami nagyobb sejtszámot, magasabb vírushozamot és magasabb vírustitert jelent [Gey, G. O.: Am. J. Cancer 17, 752 (1933); Ray-, mond C. Parker: „Methods of tissue culture, Hoe- 50 ber Medical Division USA 1961”, harmadik kiadás]. Amennyiben a szövettenyészethez a BKH 21 sejtvonalat alkalmazzuk (újszülött hörcsög veséjéből kialakított sejtvonal, lásd: J. Natl. Cancer Inst. 1963, 30, 795; beszerezhető: Flow Laboratories Limited, P. O. Box 17, Irvine, Ayrshire, Scotland), szuszpenziós vagy mikrohordozós tenyészetet is alakíthatunk ki. A mikrohordozós tenyészet lényege, hogy az összefüggő sejtréteg nemcsak a tápközeget tartalmazó edény falán, hanem a tápoldatban lebegő műanyaggömbök felületén is kialakul, ami nyilván a hasznos felület növekedésével jár (van Wenzel, A. L., Nature 216, 64-65 (1967)]. 65 55 60 A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. A példákban említett tápközegek öszszetételét az alábbi irodalmi helyek tárgyalják: Earle oldat: Earle, W. R.: Arch. exp. Zellforsch. 76 116 (1934), Hanks oldat: Hanks, J. H.: J. cell. comp. Physiol. 31, 235 (1948) MEM-E: Earle, W.: J. Nat. Cancer Inst. 4, 165 .1943) Eagle, H.: Science 130, 433 (1959) MEM-H: Hanks, H.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 'll, 196 (1949). 7. példa a) Az oltóvírus előállítása Az Aujeszky-féle betegség heveny járványesetből izolált, és az OKI-nél 00 236/82 szám alatt deponált ú.n. Phylaxia virulens vírustörzzsel 2-2,5 kg-os nyulakat intracerebrálisan fertőzünk. Az Aujeszkyféle betegségre jellemző tünetek mellet 72-96 órás lappangási idő után elhullott nyulak agyvelejét steril körülmények között kivesszük és fiziológiás konyhasó-oldattal készített 10%-os szuszpenzióját használjuk tömeges vírusszaporításra. b) A vírusszuszpenzió előállítása Az a) pont szerint előállított „Phylaxia” jelű virulens Aujeszky vírustörzset primer tyúkembriófibroblaszt, vagy primer borjúhere egyrétegű sejttenyészetben, 2000 ml-es Roux palackokban vagy rolling berendezés forgó palackjaiban elszaporítjuk. A sejtszaporítás történhet sejtvonalakon (BHK-21) szuszpenziós vagy mikrohordozós kultúrában is. A sejttenyészetek növesztő folyadékának Hanks vagy MEM-H oldatot, fenntartó és vírusszaporító folyadéknak Earle vagy MEM-E o datot használunk. A sejtszaporításhoz használt Hanks vagy MEM-H oldatot 10% növendék marhasavóval kiegészítve alkalmazzuk, a vírusszaporítc oldatok savót nem tartalmaznak. Az egyrétegű sejttenyészet kialakulása után a növesztő folyadékot leváltjuk, majd a tenyészetekre vírustartalmú fenntartó folyadékot öntünk. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a teljes sejtkárosító hatás megjelenéséig (48-72 óra). A learatott vírusszuszpenzió akkor alkalmas az inaktivált Aujeszky vakcina előállítására, ha steril, és sejttenyészatben mért infektív titere legalább 107 TCID50/ ml c) Inaktiválás, adjuválás, kiszerelés A b) pont szerint előállított vírusszuszpenziót inaktiváljuk. Az inaktiválást 200 tm/ml koncentrációjú, felhasználás előtt brómetilaminból ciklizált etilénimin oldattal végezzük, 37 °C hőmérsékleten, 6 órán át. Az etilénimint nátrium-tioszulfáttal semlegesítjük, majd az inaktivált vírusszuszpenzió pH- ját 7,2-7,4 értékre állítjuk be. Az élővírustartalom inaktiválódását az előbb leírt sejttenyészetekre való oltással valamint 2-2,5 kg-os nyulak és 25-30 kgos juhok oltásával lehet ellenőrizni. A vírusanyagot ezután az immunizálóképesség fokozása érdekében azonos mennyiségű „Phylaxia” inkomplett olajos adjuvánssal keverjük össze. A vizes fázisú szuszpenziót és az olajos adjuvánst 3
