187390. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-oxo-delta1,4-szteroid-származékok előállítására
1 . 187 390 2 1. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Erlenmayer-lombikban levő 1 liter steril tápközeget, melynek összetétele az alábbi: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, pH = 7 értékre beállítva. A beoltott tápközeget 30 °C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. • b) 50 literes fermentorban 30 liter steril tápközeget beoltunk 1 liter fenti Arthrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetet 30 ’C hőmérsékleten levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. A tápközeg összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. c) 7,5 g 9ß,llß-epoxi-17a-hidroxi-16ß-metil-4- pregnen-3,20-diont feloldunk 300 ml etilénglikolmonometil-éterben, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 12 g kobalt(II)-szulfát-víz (1/7) [régebbi nevén kobalto-szulfát-heptahidrát = CoS04-7H2OJ és 12 g ammónium-szulfát [(NH4)2S04] 500 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 50 literes fermentorba beadagolunk 30 liter steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,3 % protein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 3 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel /b) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril 9ß,llß-epoxi-17a-hidroxi- 16ß-metil-4-pregnen-3,20-dion-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint készített oldatot, amely az adalékanyagokat tartalmazza. Ezután a fermentációt még 20 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 5 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 20-20 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 'C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából aíuminium-oxidon kromatografáljuk. Ily módon 5,8 g 9ß,llß-epoxi-17a-hidroxi-16ßmetil-l,4-pregnadien-3,20-diont kapunk, melynek olvadáspontja 212/213-214 *C. 2. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Erlenmayer-lombikban levő 1 liter steril tápközeget, melynek összetétele az alábbi: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, pH = 7 értékre beállítva. A beoltott tápközeget 30 °C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. b) 50 literes fermentorban 30 liter steril tápközeget beoltunk 1 liter fenti Arthrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetet 30 'C hőmérsékleten levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. A tápközeg összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Plunoric, pH = 7 értékre beállítva. c) 7,5 g 17a-hidroxi-16ß-metil-4,9(ll)-pregnadien-3,20-diont 60 °C-on feloldunk 150 ml etilénglikol-monometil-éterben, majd az oldatot sterilre szüljük. d) 18 g kobalt(II)-szulfát-viz (1/7) és 18 g ammónium-szulfát 500 ml vízzel készített oldatát előbb 6,5 pH-ra beállítjuk, majd az oldatot sterilizáljuk. e) 50 literes fermentorba beadagolunk 30 liter steril táptalajt, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,3 % protein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 3 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel /b) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril 17a-hidroxi-16ß-metil- 4,9(1 l)-pregnadien-3,20-dion-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint készített oldatot, amely az adalékanyagokat tartalmazza. Ezután, a fermentációt még 24 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 5 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 20-20 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 *C hőmérsékleten vákuumban 'bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából aluminium-oxidon kromatografáljuk. Ily módon 6,2 g 17a-hidroxi-16ß-metii-l,4,9(l 1)pregnatrien-3,20-diont kapunk, melynek olvadáspontja 177-178 *C. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
