187390. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-oxo-delta1,4-szteroid-származékok előállítására
1 . 187 390, 2 3. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Eflenmayer-lombikban levő 1 liter steril tápközegéi, melynek összetétele az alábbi: 0,5 % kukoricalekvár, • 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, pH = 7 értékre beállítva. A beoltott tápközeget 30 *C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. b) 30 literes fermentorban 20 liter steril tápközeget beoltunk 1 liter fenti Arthrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetet 30 °C hőmérsékleten levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. A tápközeg összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. c) 6 g 21-acetoxi-17a-hidroxi-16-metilén-4-pregnen-3,ll,20-triont feloldunk 300 ml hexametilfoszforsav-triamidban, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 9 g kobalt(II)-szulfát-víz (1/7) és 9 g ammónium-szulfát 500 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékűre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 30 literes fermentorba beadagolunk 20 liter steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,3 % protéin-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 1,5 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel fb) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril 21-acetoxi-17a-hidroxi-16- metilén-4-pregnen-3,ll,20-trion-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint előállított oldatot, amely a hozzátétanyagokat tartalmazza. A fermentációt még 16 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 3 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 10-10 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 °C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából alumínium-oxidon kromatografáljuk. Ily módon 4,5 g 17a,21-dihidroxi-16-metilén-l,4- pregnadien-3,ll,20-triont kapunk, melynek olvadáspontja 218-219 *C. 4 4. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Erlenmayer-lombikban levő 1 liter steril tápközeget, melynek összetétele az alábbi: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, pH = 7 értékre beállítva. A beoltott tápközeget 30 °C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. b) 30 literes fermentorban 20 liter steril tápközeget beoltunk 1 liter fenti Arthrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetet 30 °C hőmérsékleten levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220' fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. Ä A tápközeg összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. c) 6,0 g llß,17aa,21-trihidroxi-D-homo-4-pregnen-3,20-diont feloldunk 150 ml hexametil-foszforsav-triamidban, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 9 g kobalt(II)-szulfát-víz (1/7) és 9 g ammónium-szulfát 400 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékűre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 30 literes fermentorba beadagolunk 20 liter steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,3 % protein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 1,5 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel /b) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 *C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril llß,17aa,21-trihidroxi-D- homo-4-pregnen-3,20-dion-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint előállított oldatot, amely a hozzátétanyagokat tartalmazza. A fermentációt még 18 órán át folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 3 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 15-15 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 'C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából alumínium-oxidon kromatografáljuk. Ily jnódon 5,0 g llß,17a,a,21-trihidroxi-D- homo-l,4-pregnadien-3,20-diont kapunk, melynek olvadáspontja 248-249 ’C (bomlás közben). 5. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétli-5 .10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
