187388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és preparátum agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására és eljárás a preparátum előállítására
187 388 2 500 ul IV. oldat, 10 >il I.b. oldat, 10 ul V. oldat, és 500 ni III. szuszpenzió Az elegyet 20 percig 4 °C-on inkubáljuk, majd Whatman GF/C jelű mikropórusos üvegszűrőn kiszűrjük a szilárd anyagot. A szilárd anyagot 10 ml ismert összetételű folyadékszcintillációs mérőoldattal keverjük össze, a szuszpenziót 1 órán át jégszekrényben állni hagyjuk, majd összerázzuk, és meghatározzuk a szuszpenzió radioaktivitását. Az így kapott radioaktivitás-értéket Cc-vel jelöljük; ez a preparátum által megköthető teljes y-aminovajsav-mennyiség. (b) A radioaktívon jelzett y-amino-vajsav leszorítása nem radioaktív y-amino-vajsavval (Cx értékek meghatározása): Az (a) pontban közöltek szerint járunk el, azonban 10 pl V- oldat helyett rendre 10-10 pl II-C., II.d., Il.e., Il.f., illetve II.g. oldatot használunk fel. A mért radioaktivitás-értékeket C„-szel jelöljük. (c) Nem specifikusan kötött y-amino-vajsav mennyiségének (Cb érték) meghatározása: Az (a) pontban közöltek szerint járunk el, azonban 10 pl V. oldat helyett 10 ni H a. oldatot használunk fel. Ebben az esetben a preparátumról a specifikusan kötött3 H-y-amino-vajsav teljes mennyiségét leszorítjuk nem radioaktiv y-amino-vajsawal. A minta radioaktivitását mérve korrekciós faktort kapunk, amely a preparátumhoz nem specifikusan kötődő 3H-y-amino-vajsav mennyiségét jellemzi. Ezt a korrekciós értéket (Cb érték) a kalibrációs egyenes felvételekor levonjuk a Cc és Cx értékekből. A mérési eredményeket az I. táblázatban közöljük. 1. táblázat Oldat jele Inaktív y-aminovajsav koncentrációja nM Beütés dpm cc-cb cx-cb Il.a. 105 160 — II.c. 10 2049 2,15 Il.d. 7,5 2367 1,84 Il.e. 5,0 2780 1,55 II.f. 2,5 3284 1,30 Ilg. 1,0 3754 1,13 V. 4221 1,00 A Cc-CJCx-Cb értékeket az inaktiv y-aminovajsav koncentrációjának függvényében ábrázolva kalibrációs egyenest kapunk. Testnedv y-amino-vajsav koncentrációjának meghatározása esetén úgy járunk el, hogy a 10 pl pufferoldat (V„ oldat) vagy ismert koncentrációjú inaktív y-amino-vajsav-oldat helyett 10 pl testnedvet adunk az elegyhez, majd méljük a preparátum radioaktivitását, és a kalibrációs egyenesről leolvassuk a mért radioaktivitáshoz tartozó y-aminovajsav koncentrációt. 3. példa Agyi receptorokhoz specifikusan kötődő egyéb anyagok mennyiségi meghatározása 3.1. iH-Diazepám kötődésének meghatározása 5 mg, az 1. példa szerint előállított liofilizált receptor preparátumot 0,9 ml vizes trisz-citrát pufferoldat (pH = 7,1) és 0,1 ml kétszer desztillált víz elegyében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2 nM 3H-diazepámot adunk, 30 percig 4 °C-on inkubáljuk, majd a szilárd anyagot Whatman GF/C jelű mikroporózus üvegszürőn leszűrjük, és nyolcszor 2,5 ml jeges trisz-citrát pufferoldattal mossuk. A radioaktivitást a 2. példában közöltek szerint mérjük. így a preparátum teljes kötőkapacitását (Cc) határozzuk meg. A kalibrációs egyenest a 2. példában ismertetett leszorításos módszerrel veszszük fel, és a nem specifikusan kötött 3H-diazepám mennyiségét (korrekciós faktor, Cb) a 2. példában ismertetett módon határozzuk meg. 3.2. y-Amino-vajsav-függő 3H-diazepám kötődésének meghatározása: A 3.1. példában közöltek szerint járunk el, azonban az inkubálási elegyhez 2 x 10 5 mól y-aminovajsavat is adunk. 3.3. Ca2*-függő 3H-y-amino-vajsav kötődésének meghatározása 5 mg, az 1. példa szerint előállított liofilizált receptor preparátumot 0,9 ml trisz-HCl pufferoldat (pH = 7,4) és 0,1 ml kétszer desztillált viz elegyében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz kalciumkloridot (koncentrációja a szuszpenzióban 250 mM), 3H-y-amino-vajsavat (koncentrációja a szuszpenzióban 5,4 nM) és 1,2,3,6-tetrahidro-piridin-4-karbonsavat (izoguvacint) adunk. Az izoguvacin, melynek koncentrációja a szuszpenzióban 40 pM, meggátolja a Ca2+ független ^-y-aminovajsav specifikus kötődését, és ezáltal növekszik a teszt érzékenysége. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a szilárd anyagot leszűrjük és szobahőmérsékleten trisz-HCl pufferoldattal (pH = 7,4) mossuk. A radioaktivitást a 2. példában közöltek szerint mérjük; a korrekciós faktort (Cb) a 2. példában ismertetett módszerrel határozzuk meg. 3.4. 3H-Dihidroalprenolol meghatározása: 5 mg, az 1. példa szerint előállított liofilizált receptor preparátumot 1 ml trisz-HCl pufferoldatban (pH = 8,0) szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2 nM 3H-dihidroalprenololt adunk, 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a szilárd anyagot leszűrjük és szobahőmérsékleten trisz-HCl pufferoldattal (pH = 8,0) mossuk. A radioaktivitást a 2. példában közöltek szerint mérjük; a korrekciós faktort (Cb) a 2. példában ismertetett módszerrel határozzuk meg. A specifikusan kötött 3H-ligandumok mennyiségét (Cc-Cb) a 2. táblázatban közöljük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
