187372. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-O antibiotikum előállítására
1 . 187 37: 2 előállítása céljából. Az így kapott inokulum 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét egy 200 térfogatrész méretű, 40 térfogatrész táptalajt tartalmazó fermen torba adagoljuk. A táptalaj összetétele a következő: 5% dextrin, 3% kukoricacsávázó folyadék, 0,1% polipepton, 0,5% CaC03, pH 7,0. A táptalajon 28 °C-on 90 órán át tenyésztést végzünk egy inokulum előállítása céljából (oltótenyészet). Sorozat hígítási technikával meghatározva, vizsgálati mikroorganizmusként Tetrahymena pyriformis W-t és összehasonlítóként C-15003 P-3 antibiotikumot használva a fenti tenyészet titer értéke 25 //g/ml-nek adódik. 2. példa 10 térfogatrész, az 1. példában kapott inokulumot égy 2000 térfogatrész méretű, 500 térfogatrész oltó tenyészet táptalajt tartalmazó fermentorba viszünk (a táptalaj az 1. példában megadottal azonos), és 48 órán át 28 °C-on inkubálást végzünk. A kapott tenyészet 500 térfogatrésznyi mennyiségét egy 50 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült tartályba visszük, amely 30 000 térfogatrész oltó tenyészet közeget tartalmaz, és a tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (280 fordulat/perc Vi DT) és 1 kg/cm2 belső nyomás alatt. A kapott oltótenyészetet 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült, 100 000 térfogatrész az 1. példában használthoz hasonló táptalajt tartalmazó fermentorba adjuk 10% inokulációs sebesség mellett. A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk, levegőztetés (100 000 térfogatrész/Tperc), keverés (200 fordulat/perc) és 1 kg/cm2 belső nyomás mellett, 90 órán át. Az 1. példában leírt módszerrel meghatározva a kapott tenyészet there 25 pg/ml. 3. példa 95 000 térfogatrész a 2. példában kapott tenyészethez 2000 súlyrész Hyflo-supercel®-t (Johnes és Manville Products, USA) adunk, és alapos keverés után az elegyet nyomószűrőn szűrjük, 85 000 térfogatrész szűrletet és 32 000 súlyrész nedves sejtet kapunk. A 85 000 térfogatrész szürletet keverjük, és 30 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos rétegeket összegyűjtjük, kétszer 30 000 térfogatrész vízzel mossuk, 500 súlyrész vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 térfogatrész mennyiségre koncentráljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk, és a kapott csapadékot (53 súlyrész) szűréssel elkülönítjük. Ezt az (I) általános képletű nyers terméket elkeverjük 100 térfogatrész etilacetáttal, és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. A szürletet 10 súlyrész szilikagéllel keverjük el (Merck, NSZK, 0,05-0,2 mm), és az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 400 térfogatrész méretű szilikagél oszlop tetejére. Az eluálást 500 térfogatrész hexánnal, 500 térfogatrész 3 : 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1: 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1: 3 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész etilacetáttal és 1000 térfogatrész 50 : 1 arányú etilacetát-metanol eleggyel végezzük, az eluátumokat 100 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtve össze. Minden frakció 1 térfogatrésznyi mennyiségét szárazra pároljuk, és 0,1 térfogatrész etilacetátot adunk a koncentrátumhoz. A kapott elegy egy szilikagél üveglap (Merck, NSZK, 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20) alsó sarkától számítva 2,5 cm-re'ad foltot, és egy 19: 1 arányú etilacetát-metanol oldószer rendszerrel körülbelül 17 cm-re hívható elő. Előhívás után a detektálást ultraibolya fénnyel végezzük (hullámhossz: 2537 Â). A 23-28 számú aktív frakciókat, amelyek a 0, 5-0,65 Rf értéknek felelnek meg, összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson, körülbelül 20 térfogatrésznyi köbtartalomra koncentráljuk. A kapott koncentrátumhoz 150 térfogatrész petrolétert adunk, és így 15 súlyrész (II) képletű nyersterméket ka* punk. 4. példa Keverés közben a 3. példában kapott nedves sejtek 32 000 súlyrésznyi mennyiségét 50 000 térfoga trész 70%-os aceton-víz eleggyel extrahéljuk 3 órán át, majd nyomószürőn szűrjük. Az 50 000 té rfogatrész 70%-os aceton-viz eleggyel végzett extrahálást és az azt követő szűrést megismételjük. A szürleteket összegyűjtjük, és az acetont csökkentett nyomáson végzett betöményítéssel eltávolítjuk. A kapott vizes rendszert 5000 térfogatrész méretű Diaion HP-10 oszlopon hajtjuk át (Mitsubishi Kaséi K. K.). Az oszlopot 20 000 térfogatrész vízzel és 50%-os vizes metanollal mossuk, majd 15 000 térfogatrész 90%-os metanol-víz eleggyel eluáljuk. Az el iátumot csökkentett nyomáson 3000 térfogatrészre koncentráljuk, és 3000 térfogatrész vízzel és 3000 térfogatrész etilacetáttal kirázzuk. A fenti eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos rétegeket egyesítjük, vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 térfogatrészre koncentráljuk. A petrcléter hozzáadása után a csapadékot szűréssel elkülönítjük (28 súlyrész). A fenti terméket egy szilikagél oszlop segítségével tisztítjuk, és így 8,0 súlyrész (II) képletű terméket kapunk. 5. példa 10 térfogatrész etilacetátban feloldunk 1,5 súlyrész (II) képletű nyers terméket, amelyet a 3. példában kaptunk, majd az oldatot jól elkeverjük 4 súlyrész szilikagéllel (Merck, NSZK, 0,05-0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 300 térfogatrészes szilikagél oszlop tetejére, és az oszlopot először 500 térfogatrész kloroformmal mossuk, majd 500 térfogatrész 20:1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 10 : 1 térfogatarányú kloroform-metanol elegygyel eluáljuk. Az eluátumokat 25 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük. Mindegyik frakció 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A kapott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
