187372. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-O antibiotikum előállítására

1

2

187 372

koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk, és az elegyet, mint mintát szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás eljárással vizsgáljuk (előhívó rendszer 9 : 1 arányú kloroform-metanol elegy).

Az Rf 0,50-0,60 zónában 2537 Á-nél abszorbeáló 39 és 40 számú frakciókat összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 2 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ily módon 0,150 súlyrész C-15003 antibiotikum kristályt nyerve.

A fenti 0,150 súlyrész C-15003 antibiotikum kristályt feloldjuk 15 térfogatrész metanolban, majd 0,300 súlyrész nátriumkloridot és 15 térfogatrész vizet adunk az elegyhez. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP-10-zel (Mitsubishi Kaséi K. K.) és 600 térfogatrész, 50%-os metanol-víz eleggyel kalibráljuk, amely 5% nátriumkloridot tartalmaz. A fenti módon előállított minta oldatokat átengedjük az oszlopon, és gradiens technikával eluálunk, 1500 térfogatrész 60%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz eleggyel és 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz eleggyel. Az eluátumokat 15 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük, és valamennyi frakciót megvizsgáljuk szilikagél vékonyréteg-kromatográfiával. A 145-153 frakciók C-15003 P-3, a 167-180 frakciók a C-15003 P-3' és a 185-190 frakciók a C-15003 P-4 antibiotikumot tartalmazzák.

Valamennyi frakciót koncentráljuk, csökkentett nyomáson. A koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk, és az elegyből vett mintát szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk, előhívórendszerként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használva.

Az Rf 0,50-4),60 zónában 2537 Á-nél abszorbeáló 39 és 40 frakciókat összegyűjtjük, és szárazra pároljuk csökkentett nyomáson. A maradékhoz 2 térfogatrész etilacetátot adunk, és az elegyet állni hagyjuk, így 0,150 súlyrész C-15003 antibiotikum kristályt állítva elő.

A kapott 0,150 súlyrésznyi mennyiségű C-15003 antibiotikum kristályokat feloldjuk 15 térfogatrész metanolban, majd;0,300 súlyrész nátriumkloridot és 15 térfogatrész vizet adunk hozzá. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP-10-zel (Mitsubishi Kaséi K. K.) és 600 térfogatrész 50%os metanol-víz eleggyel kalibráljuk, amely 5% nátriumkloridot tartalmaz. A fenti módon elkészített mintaoldatot átengedjük az oszlopon, majd gradiens eluálást végzünk, 1,500 térfogatrész 60%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz elegyet és 1,500 térfogatrész 95%-os metanol-víz elegyet használva. Az eluátumot 15 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük össze, és minden egyes frakciót megvizsgálunk vékonyréteg-kromatográfiás eljárással, szilikagél hordozón. A 145-153 frakciók a C-15003 P-3-at, a 167-180 frakciók a C-15003 P-3'-t és a P-4 elegyét, míg a 185-190 frakciók a C-15003 P-4-et tartalmazzák.

Valamennyi frakciót koncentráljuk, és feloldjuk 50 térfogatrész víz és 100 térfogatrész etilacetát hozzáadásával. Az oldatokat egy elválasztó tölcsérben összerázzuk, és a vizes réteget elkülönítjük, kétszer 50 térfogatrész vízzel végzett mosás után, az etilacetátos réteget^zmentes nátriumszulfát felett

szárítjuk, koncentráljuk és állni hagyjuk. A fenti módon valamennyi frakcióból kristályokat kapunk.

A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárít- 5 juk.

C-15003 P-3 0,070 súly rész

C-15003 P-3', P-4 0,018 súlyrész

C-15003 P-4 0,015 súlyrész

1D A C-15003 P-3' és P-4 (0,018 súlyrész) elegykrisu tályait feloldjuk 0,3 térfogatrész etilacetátban és szilikagél üveglemezen (Merck, NSZK, Kiesselgel 60 F 254 0,25 mm, 20 x 20) az alsó széltől számítva 2,5 cm-re egy foltot kapunk, amelyet etilacetát és 15 metanol 19 : 1 arányú elegyével hívunk elő. Az előhívás után körülbelül 18 cm-ig, az Rf 0,68 (P-4) és az Rf 0,65 (P-3') abszorpciós sávokat összegyűjtjük és egymástól függetlenül kétszer egy kis mennyiségű vizet tartalmazó etilacetáttal extraháljuk. A ka- 2o pott etilacetátos extraktumot vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, csökkentett nyomáson koncentráljuk és állni hagyjuk.

A C-15003 P-4 kristályokból 0,01 súlyrész, a C-15003 P-3' kristályokból pedig 0,003 súlyrész 25 mennyiséget kapunk az Rf 0,68 és Rf0,65 frakciókból.

6. példa

30

1000 térfogatrész 2. példa szerinti tenyészetet egy 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes tartályba oltunk, amely 100 000 térfogatrész oltótenyészet táptalajt tartalmaz és a beoltott táptalajt 28 °C-on, levegőztetés mellett (100 000 térfogatrész/min) és keverés (200 fordulat/perc) 48 órán át inkubáljuk.

5 A kapott oltótenyészetet egy 2 000 000 térfogatrész méretű rozsdamentes acélból készült tartályba viszszük, amely 1 000 000 térfogatrész az 1. példában leírthoz hasonló fermentlét tartalmaz. Az átvitel sebessége 10%. A tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (1 000 000 térfogatrész/perc) és keveréssel (120 fordulat/perc) végezzük, a belső nyomást 1 kg/cm2 értéken tartva. A tenyésztés ideje 90 óra. A kapott tenyészet titerét 20 /ig/ml-nek találtuk az 1. példában leírt eljárással vizsgálva.

45 A fenti tenyészet 900 000 térfogatrésznyi menynyiségéhez 900 000 térfogatrész acetont adunk és, ;gy órás keverés után, 20 000 súlyrész Hyflo-supercel-t (Johnes és Manville, USA). Az elegyet tovább keverjük és nyomószűrőn szűrjük.

50 A kapott szűrlet 1 700 000 térfogatrésznyi merfvnyiségéhez 500 000 térfogatrész vizet adunk és, egy Podbielniakban (Podbielniak Inc.) az elegyet 1 000 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízzel mossuk, vízmentes nátri- 55 umszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett lyomáson koncentráljuk. A koncentrátumhoz peti-olétert adunk és a kapott precipitátumot szűréssel kinyerjük, majd szárítjuk. A fenti eljárással 68 súly'ész (I) általános képletű nyers terméket kapunk. 60 Ezután a 3., 4. és 5. példákban leírt módon a nyersterméket tisztítjuk. 9,5 súlyrész C-15003 P-3,0,300 .úlyrész C-15003 P-3' és 2,5 súlyrész C-15003 P-4 antibiotikumot kapunk.

A C-15003 P-0 antibiotikum előállítását ismer- 65 tető példa:

10