187334. lajstromszámú szabadalom • Készítmény észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására
1 187 334 2 9. példa. 4~Metoxi-2~morfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borát. 18,76 g (0,1 mól) 3-klór-4-nitro-anizolt (olvadáspont: 52 °C) 87,1 g (1 mól) morfolinnal 4 órán át forralunk visszafolyó hűtő alatt. Utána lehűtjük szobahőmérsékletre, a reakcióelegyhez 100 ml jeges vizet adunk, a kivált sárga reakcióterméket kiszűrjük, jéghideg 10%-os ecetsavoldattal mossuk, és a kapott anyagot vákuumban 60 °C-on szárítjuk. így 19,5 g N-(3-hidroxi-6-nitro-fenil)-morfolinból és N-(3-metoxi-6-nitro-fenil)-morfolinból és N-(3- metoxi-6-nitro-fenil)-morfolinból álló keveréket kapunk. Ezt a terméket diklór-metánban oldjuk, és dietil-éteres diazometán-oldatot adunk hozzá. Szobahőmérsékleten 2 napig állni hagyjuk, majd utána a fölösleges diazometánt 2 n ecetsavoldat hozzácsepegtetésével elbontjuk, a szerves fázist többször összerázzuk 2 n nátrium-hidroxid oldattal, és az oldószert vákuumban eldesztilláljuk. így 19,1 g (80,2%) N-(3-metoxi-6-nitro-fenil)-morfolint kapunk, amelynek olvadáspontja 84-86 °C. Ezt az anyagot végül 250 ml metanolban szuszpendáljuk, és 1,9 g 10%-os palládiumosszén hozzáadásával 20-30 °C-on hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után alaposan bepároijuk, és a felszabadított bázist dietil-éteres sósavoldattal a hidrokloriddá alakítjuk. 20,6 g (73,1%) N-(3-métoxi-6-aminofenilj-morfolino-dihidroklorid kristályosodik ki, amelynek olvadáspontja 237-240 °C. Ezt az anyagot - 5 °C-on 96 ml 6 n sósavoldatban szuszpendáljuk, és 30 perc alatt hozzácsepegtetjük 6 g nátrium-nitrit 12 ml vízzel készült oldatát. A keletkező barnásvörös diazóniumsóhoz 0 °C-on keverés közben 120 ml 35%-os tetrafluorobórsav-oldatot adunk. Több órás állás után 19,5 g (63,5%) 4-metoxi-2-morfolino-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot kapunk sárga kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 115-116 °C (bomlás). Hasonló módon kapjuk a) 5-klór-2-nitro-anizolból és tiomorfolinból a 2-metoxi-4-(N-tiomorfolino)-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot; olvadáspont 106-108 °C (bomlás). A köztitermék 2-amino-5-(N-tiomorfolino)anizol-dihidroklorid a következőképp állítható elő: Keverővei ellátott 1 literes háromnyakú lombikban 100 g ón(II)-klorid-dihidrátot oldunk 400 ml 6 n sósavoldatban, és szobahőmérsékleten keverés közben részletekben hozzáadunk 25,4 g (1 mól) 2-nitro-5-(N-tiomorfolino)-anizolt. Utána 30 percig 75 DC-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hütjük, és a reakcióelegyet jeges hűtés közben 750 ml 30%-os nátrium-hidroxid oldatba öntjük. A felszabadított bázist dietil-éterrel többször extraháljuk, és ezt szárítás és az oldószer részbeni eldesztillálása után dietil-éteres sósavoldat hozzáadásával a hidro-kloriddá alakítjuk át. így 24,9 g (83,8%) 2-amino-5-(N-tiomorfolino)-anizol-dihidrokloridot kapunk, amelynek olvadáspontja 218-220 °C. b) 5-klór-2-nitro-anizolból és piperidinből a 2- metoxi-4-piperidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot. Olvadáspont: 123-125 °C (bomlás). ;) 5-klór-2-nitro-anizolból és pirrolidinből a 2- metoxi-4-pirrolidino-benzol-diazónium-tetrafluoro bórától. Olvadáspont: 137-139 °C (bomlás), j) 5-klór-2-nitro-anizolból és N-metil-piperazinbcl a 2-metoxi-4-(4-metil-piperazinil)-benzoldi.izónium-tetrafluoroborát-dihidro-tetrafluoroborá;ot, amelynek olvadáspontja 163 ’C (bomlás). Ennek a vegyületnek az előállításánál a diazotálá'.t amil-nitrittel metanolban végezzük. E célból 39,6 g (0,1 mól) 2-amino-5-(4-metil-piperazinil)arizol-dihidro-tetrafluoro-borátot oldunk 175 ml m Manóiban, hozzáadjuk 11,6 g (0,1 mól) amilniirit 25 ml metanollal készült elegyét, és 0 °C-on la>san, keverés közben 60 ml 35%-os tetrafluoroborsavat csepegtetünk hozzá. Állás közben 24,8 g (51,7%) barnás kristályos 2-metoxi-4-(4-metil-piper. izinil)-benzol-diazónium-tetrafluoroborát-dihidrc -tetrafluoroborát válik ki, amelynek olvadáspontja: 163 °C (bomlás). e) 5-klór-2-nitro-anizolból és morfolinból a 2- iaetoxi-4-morfolino-benzol-diazónium-tetrafluorc-borátot, amelynek olvadáspontja 166-168 °C (bomlás). 10. példa Indikátorkeverék 71,7 mg N-tozil-L-alanin-indoxil-észtert 7,5 g foszforsav-trimorfolidot és 80 mg, az 1. Táblázatban felsorolt diazóniumsót porkeverékként - 98 rész etanolból és 2 rész dekanolból képezett - 100 ml mennyiségű elegyben cldunk. Az így kapott oldat 2 cseppjét mikrotiter lemezen clyan vizes oldat 2 cseppjével egyesítjük, amely t eljes vérből mikroliterenként 1000 leukocitát és 0,2 noláros, bórax/sósav puffért (pH = 8) tartalmaz, najd a reakciót 1 perc múlva kiértékeljük. Az összehasonlító eredményeket a következő táblázat szemlélteti: Táblázat diazóniumsó leukociták 1000/pl reakciószín 1. képletű vegyület + zöld 2. képletü vegyület + zöld 3. képletű vegyület + zöld 4. képletű vegyület + zöld 5. képletű vegyület + zöld 6. képletű vegyület + ibolya 7. képletű vegyület ( + ) vöröses ibolya 8. képletü vegyület + vörösbarna 9. képletű vegyület ( + ) vöröses ibolya 10. képletü vegyület ( + ) vöröses ibolya 11. képletű vegyület + vörös 12. képletű vegyület + vörös 13. képletü vegyület + vöröses ibolya 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
