187334. lajstromszámú szabadalom • Készítmény észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására
1 187 334 2 B: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5-metilindol, C: 3-[N-(béhzilöXi-karbonil)-L-alaniloxi]-7-metilindol, D: 3-[N-(befiziloxi-karboniI)-L-aIaniloxi]-4-kIórindol, E: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5-brómindol, F: 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol, G: 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-5-metoxi-indol, H: 3-[N-(4'-acetilamino-benzolszulfonil)-L-alaniloxi]-indol, I: 3-[N-(4'-metoxi-tozil)-L-alaniloxi]-indol, K: (N-tozil-L-alaniloxi)-benzoi, L: 1 -(N-tozil-L-alaniloxi)-naftalin, M: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3-metoxi-benzol. Az így kapott reagenspapírokkal leukocitatartalmú vizeletben 100 leukocita/pl kimutatható. összehasonlító reaktivitással rendelkező reagenspapírok is készíthetők, ha a fent nevezett diazóniumsók helyett 2-metoxi-4-pirrolidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot, 2-metoxi-4-piperidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot, 2,6-dimetoxi-4-morfolino-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot, 4-metoxi-2-morfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot, 2-metoxi-4-(4-metil-piperazinil)-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot, 2-metoxi-4-tiomorfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot használunk. 3. példa A következő törzsoldatokat készítjük: 1. oldat: 2xl0_n mól/liter l-(N-tozil-L-alaniloxi)-4-izopropoxi-naftalin, 10 2 mól/liter 2,4-dimetoxi-benzol-diazóniumtetrafluoro-borát aceton/l-dekanol (98 : 2) elegyben oldva. 2. oldat: 0,2 mólos bórax-sósav puffer, 10% foszforsav-trimorfolid. Miután vagy az 1. oldathoz vagy a 2. oldathoz hozzáadtuk az alább felsorolt aktivátorokat az ott megadott koncentrációkban, a szűrőpapírokat átitatjuk az 1. és 2. oldatokkal, és 60 °C-on megszárítjuk. Az ellenőrző vizsgálat során 300 leukocita/pl leukocita-tartalmú izotóniás nátrium-klorid oldatban a tesztek az alább megadott idők alatt reagáltak. Aktivátor 1 mg aktivátor-adalék 20 ml reakciót [sec] . oldathoz 2. oldathoz semmi — — 54 4-azafluorén 33 17 benzo-[h]-kinolin 36 8 kinin 33 32 l,2-bisz(4-piridil)-etilén 37 34 1-dekanol 400 5 1-tetradekanol 400 4 Aktivátor 1 rtlg aktivátor-adalék 20 ml reakcióidő [sec] . oldathoz 2. oldathoz nitroprusszfd-nátriuttl 31 38 tetrakálium-hexacíano-40 30 ferrát (II) 4. példa Szűrőpapírt átitatunk a következő oldatokkal, és az átitatás után 60 °C-on szárítjuk. 1. oldat: 2x 10~3 mól/liter 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol, 2x 10~3 mól/liter 2-metoxi-4-morfolino-benzoldiazónium-tetraklór-cinkát aceton/l-dekanol (98 : 2) elegyben oldva. 2. oldat: 0,2 mólos bórax-sósav puffer, pH 8, 10% foszforsav-trimorfolid. Egy további kísérletben a 2. oldatból a foszforsav-trimorfolidot elhagytuk. A foszforsav-trimorfoliddal készült minták 2 napig 60 °C-on való tárolás után színtelenek maradtak, és leukocita-tartalmú oldatokkal jó reakciókat adtak. A foszforsav-trimorfolid nélküli minták szürkén elszíneződtek. 5. példa Ismert módon reagenstablettát készítünk, amely a következő komponenseket tartalmazza: 2 mg 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol, 2 mg 2-metoxi-4-morfolino-benzol-diazóniumtetraklór-cinkát, 1,5 mg kálium-dihidrogén-foszfát, 30 mg dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, 20 mg mannit. Ezt a tablettát 2 ml leukocita-tartalmú vizeletben oldjuk, és jól összekeverjük, Leukociták jelenlétében vöröses ibolya színeződés lép fel. 100 leukocita körülbelül 2 perc alatt mutatható ki. Ha a vizeletet a tabletta hozzáadása előtt és a reakció alatt 37 °C-on temperáljuk, úgy ugyanennyi idő alatt 20 leukocita kimutatható. 6. példa l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3,5-dimetoxi-benzol. Az aktivált észteres eljárás szerinti reakcióhoz 14,6 g (0,06 mól) N-tozil-L-alanint és 12,2 g (0,09 mól) N-hidroxi-benztriazolt oldunk 300 ml vízmentes etil-acetátban, az oldatot 0 °C-ra hütjük, és 12,4 g (0,06 mól) diciklohexil-karbodiimiddel elegyítjük. Az aktivált észter képződése céljából 2 órát kevertetjük 0 °C-on, utána további 2 órát szobahőmérsékleten. Hozzáadunk 6,2 g (0,04 mól) 3,5-dimetoxi-fenolt és 5,5 ml (0,04 mól) trietil-amint, majd utána a reakcióelegyet 15 órát kevertetjük szobahőmérsékleten. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük. A szűrletet vákuumban legfeljebb 50 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
