187324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok észter-származékainak előállítására
1 187 324 2 mesterségesen; tiszta inokulumként csak MEM-et adtunk hozzájuk. 6. A tenyészeteket - hacsak másképp nem jelezzük - 16-18 órán át inkubáltuk 37 °C-on. 7. Az inokulációs időszak után a közeget dekantáltuk, valamint a sejteket 7,2-es pH-án PBS-sel egy ízben mostuk. 8. Lyukanként 5-10 ml RBC-szuszpenziót adagoltunk, és a tenyészetet 30 percen át szobahőmérsékleten tartottuk. 9. Ezt követően az RBC-szuszpenziót dekantáltuk, majd a tenyészeteket 2-3 ízben PBS-sel mostuk abból a célból, hogy a specifikusan megkötődött RBC-t csaknem teljes egészében eltávolítsuk. 10. Végül mindegyik lyukba 1,0 ml Hanks-féle pufferolt sóoldatot (HBSS) adagoltunk. 11. A hemadszorbeált RBS gócait kezdetben egy 4X-es objektívvei rendelkező Nikon invertált fáziskontraszt mikroszkóppal számláltuk. 12. A számlálásra minden esetben legalább öt, véletlenszerűen kiválasztott mezőt használtunk. 13. A HAd gócok számlálását egy Bausch and Lomb Omnicon Alpha Image Analyzer segitségével végeztük. 14. A mikroszkóp képét egy Vidicon scanner-re vetítettük ki. A képet egy televíziós ernyőre is felvittük úgy, hogy a kezelő észrevehette és a számításaiból kihagyhatta a törmelékeknek tulajdonítható hibákat. A gócokat szürkeségszinttel és képmérettel detektáltuk. 15. A visszamaradó, nem adszorbeálódott RBC-k megszámlálásának elkerülése végett egy túlméretezett számolóegységet úgy programoztunk, hogy kiszűrje az individuális RBC-ket. 16. A statisztikai analízis abban állt, hogy az adatokat varianciaszükítéses tervezési modell analízis segítségével kielemeztük. A variancia forrása a kezeléseknek, a kezelések során beágyazott lyukaknak, valamint a lyukakon belüli mezők következtében fellépő kísérleti hibáknak tulajdoníthatók. Minden lyukra kiszámítottuk a mezőnkénti átlag inficiált sejtek számát, valamint az átlag standard hibáit. A standard hibák és az átlagok kiszámítását mindegyik kezelésre is elvégeztük oly módon, hogy mindegyik kezelésen belül összegyűjtöttük a beágyazott lyukakat. A mezőnkénti inficiált sejtek átlagos számát mindegyik kezelésnél összehasonlítottuk a kontrollal, és az összehasonlításhoz a Dunnets’-féle többszörös összehasonlítási tesztet használtuk fel, tekintet nélkül az átfogó F-tesztre. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. Kontroll 1. kezelés 1. lyuk 2. lyuk 3. lyuk 1. lyuk 2. lyuk 3. lyuk F 11* F 12 F 13 F’ 11 F’ 12 F 13 F 21 F 22 F 23 F’ 21 F’ 22 F’ 23 F 31 F 32 F 33 F’ 31 F’ 32 F’ 33 x, ±SE, x2 ±SE2 x ±SE3 x, ± SE, x, ±SE, X, ±SE^ Összegyűjtött: xe ±SE„ xT ±SE t n = 9 n = 9 *) F 11: a mezők sorszámát jelzi. F) Humán perifériás vérlymphocyták (HPBL) előállítása a) Ficoll-Hypaque szeparációs közeg előállítása 1. 22,5 g Ficoll 400-at (Pharmacia; mólsúly: 400 000) feloldottunk 200 ml desztillált vízben. Mikor az oldódás már csaknem teljes volt, az oldatot desztillált vízzel felhígítottuk 250 ml térfogatra. 2. 34 g Hypaque-t (nátrium-diatrizoát; Sterling Organics; mólsúly: 636) feloldottunk 100 ml desztillált vízben. 3. Az oldatokat ezután steril körülmények között átszűrtük egy 0,45 mikronos szűrőn, majd fénytől védve 4 °C-on tároltuk steril konténerekben. 4. Felhasználásra kész oldatokat készítettünk oly módon, hogy 10 ml Hypaque oldatot összekevertünk 24 ml Ficoll oldattal. Az elegyet állandó keverés közben felmelegítettük 25 °C-ra. b) HPBL elkülönítése a vérből 1. Heparinnal kezelt, vákuumos, 20 ml térfogatú kémcsövekbe humán vérmintákat vettünk vénából. 15-20 ml hígítatlan vért óvatosan rárétegezünk egy azonos térfogatú Ficoll-Hypaque oldatra. Ezt a műveletet aszeptikusán hajtottuk végre, steril 50 ml-es polikarbonát centrifugacsöveket használva. 2. Az elkészített mintákat 25 °C-on 400 g mellett 30 percig centrifugáltuk. A határfelületen lévő homályos fehér sávot aszeptikusán átszívattuk egy 50 ml térfogatú, 10-20 ml RPMI-1640-et tartalmazó steril centrifugacsőbe. A sejteket egy ízben mostuk 25 °£-on, majd 400 g mellett 10 percig centrifugáltuk. 3. Pelletezett PBL-t minden 8 ml eredetileg felhasznált teljes vérre számítva 1 ml RPMI-ben újraszuszpendáltunk, és egy Coulter számláló segítségével számláltuk. A koncentrációt glutaminnal és antibiotikumokkal adalékolt RPMI-1640-nel állítottuk be. A sejteket felhasználásig szobahőmérsékleten tartottuk. G) HPBL stimulálása PHA-val és LPS-sel 1. Egészséges donoroktól 10-14 ml-es vérmintákat vettünk heparinnal kezelt kémcsövekbe. 2. A lymphocytákat a Ficoll-Hypaque technikával elkülönítettük a vérmintákból. 3. A vizsgálandó vegyületekből különböző koncentrációjú oldatokat készítettünk RPM 1-1640- ben. A lymphocyták koncentrációját 2xl06/ml RPMI-1640-re állítottuk be. 5. A lymphocytákat a vizsgált vegyületekkel 90 percig inkubáltuk 37 °C-on. 6. Bárány vörösvértesteket (SRBC) (1-2 hetes) 3 ízben mostuk PBS-sel, majd RPMI-1640-ben 0,5%-os végső koncentrációra hígítottuk. 7. A reakció kémcsövek az alábbi alkotórészeket tartalmazták: 0,2 ml lymphocyta (2x 106); 0,2 ml 9% Ficoll RPMI-1640-ben; és 0,2 ml SRBC (0,5%, RPMI-1640-ben). 8. A fenti reagenseket 5 percig centrifugáltuk 200 g mellett szobahőmérsékleten. 9. Az üledéket egy hemocitométerbe helyezett 10 ml-es mintában óvatosan újraszuszpendáltuk. 10. Ezután egy mikroszkóp segitségével megszámoltuk a rozettákat; rozettáknak számoltuk azokat a lymphocytákat, amelyekhez három vagy annál több vöröstest kapcsolódott. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
