187324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok észter-származékainak előállítására
1 187 324 2 H) E-r özet tát képző sejtek a) Mitogének előállítása 1. Lipoliszacharid B vagy Phytohemagglutinin P port bemértünk és 1000 mikrogramm/ml (1 mg/ ml) koncentrációban feloldottunk RPMI-1640- ben, majd steril körülmények között átszűrtük egy 0,45 mikronos szűrőn. 2. Az oldatokat aszeptikusán részekre osztottuk (1 ml/kémcső) megcímkézett kriocsövekbe,’ majd megfagyasztottuk. Részleges felhasználás után a mintákat nem fagyasztottuk le újra, hanem adott esetben 1-2 napig 4 °C-on tároltuk. A liofilizált port 4 °C-on tároltuk. b) Tenyészetek kikészítése . 1. A SOP 1-004 szerint PBL oldatot készítettünk glutaminnal és antibiotikumot, valamint gombaölő szert tartalmazó oldattal (GIBCO) adalékolt, szérummentes RPMI-1640-nel. A 96 lyukat tartalmazó mikroteszt tenyésztálcákon (CoStar Plastics) mindegyik lyukhoz 0,1 ml-t adtunk. Az adagolást nyolccsatornás, automatikus, steril feltéttel ellátott mikropipettákkal végeztük. 2. A mitogén oldatokat gyorsan felengedtettük, majd RPMI-1640-nel a kívánt koncentráció négyszeresére hígítottuk fel. 3. A SOP # C-002 szerint használatra kész vizsgálati vegyületeket RPMI-1640-nel felhígítottuk a kívánt koncentráció négyszeresére. 4. A mitogén oldatok és/vagy a vizsgált vegyületek oldataiból 50 mikroliternyit hozzáadtunk 6 párhuzamos tenyészethez. A kontroll tenyészetekhez egyszerű RPMI-1640-et adtunk 0,2 ml/lyuk menynyiségben. 5. A tenyészeteket 37 °C-on 48 órán át inkubáltuk 95% levegőt és 5% C02-ot tartalmazó nedves atmoszférában (pH = 6,0-7,0). Ezután a sejteket 0. 5 jiCi/lyuk 3H-TdR-rel (Thymidin) nyomjeleztük további 18 órán át. A sejteket többszörös párhuzamos kapcsolású automatikus mintavevővel (M. A. S. H.) gyűjtöttük össze. A nem tapadó sejteket üvegszál szűrőszalagokra szívattuk 0,9%-os sóoldattal (10 átmosás), majd a sejteket desztillált vízzel lízisnek vetettük alá (20 átmosás). A szalagokat levegőn alaposan megszárítottuk, a visszamaradó sejtlerakódásokat levágtuk a szalagokról, majd mindegyik mintát 1 dramos (1,772 g) szcintillációs üvegfiolákba helyeztük. A szcintillációs folyadékkoncentrátumot (Scintiprep 1, Fisher Chemicals) szcintillációs minőségű toluollal 1 : 50 arányban hígítottuk, majd mindegyik üvegfiolához 1 ml-t adtunk. A mintákat folyadék szcintillációs spektroszkópiás eljárással értékeltük ki, és az adatokat átlagértékekként adtuk meg (percenként és vizsgálati csoportokként). 1. Immunolemez vizsgálat aj NPT 15 392 előállítása 1. Egy 500 mikrogramm/ml NPT 15 392-t tartalmazó oldatot állítottunk elő oly módon, hogy az előre lemért gyógyszert por formájában hozzáadtuk steril PBS-hez, majd az oldatot 30 percig ultrahanggal kezeltük. 2. A GCA/McPherson kétsugaras spektrofotométer hullámhosszát 250 nm-re állítottuk be. 3. Az NPT 15 392-t 0,1 n sósavval 1 : 10 arányban felhígítottuk. 4. Csőröspohárba 15 ml 0,1 n sósavat öntöttünk. Ezt az oldatot a küvetták öblítésére használtuk. M ndkét küvettát feltöltöttük 0,1 n sósavval és leolvastuk a hullámhosszúságot. Az abszorbanciának a nullázott értéktől 0,001-0,005 értékeken belül kell lennie. 5. A mintaküvettát kiürítettük, majd hozzáadtuk a hígított gyógyszer oldatot. 6. Feljegyeztük az abszorbanciát, majd a koncentrációt az alábbi képlet szerint számítottuk: A^.bs/.orbancia) x hígítási faktor x atomsúly (278) = koncentráció [g/ml] b) A 0. nap előtt 1. NPT 15 392 oldatot készítettünk oly módon, hogy 1 ml PBS-ben feloldottunk 500 g NPT 15 392-t. 2. A koncentrációt az iménti a) pont szerint határoztuk meg. 3. Az oldatot 1 ml-es részekre osztottuk, majd több hónapig tároltuk —20 °C-on. 4. Az oldatokat felengedtettük és a kívánt koncentrációra hígítottuk. c) Agaróz bázisú lapok előállítása 1. Agaróz PBS-sel alkotott 1,4%-os szuszpenzióját (7 g 500 ml-ben) 15 percig tartottuk autoklávban. 2. Cornwell fecskendővel aszeptikusán egyenként 3 ml megömlesztett agarózt adagoltunk Faléc n A 1006 Petri-csészékbe, és az ömledéket az egyenletes réteg kialakulása végett kavartuk. 3. Felhasználásuk előtt a lapokat kívánt esetben egy hétig terjedő időtartamig tárolhattuk 4 °C-on. A lapokat fordított helyzetben (az agar a lap tetején) tároltuk. d) Tengerimalac szérum előállítása 1. Szívpungálással 10 ml vért vettünk 2-6 tengerimalactól, majd a vért antikoagulánsok távollétébcn 50 ml-es Falcon A 2070 centrifugacsövekbe helyeztük. 2. Ezeket a centrifugacsöveket 45 percig inkubáltuk 37 °C-on alvadék képzése végett. 3. Ezután a csöveket kivettük az inkubátorból, majd az alvadék zsugorítása végett 30 percig jégre helyeztük. 4. A szérumot aszeptikusán leöntöttük mindegyik csőről, a szérumokat összegyűjtöttük, 1 ml-es részekre osztottuk, majd felhasználásig - 70 °C-on tároltuk. e) Immunizálás; 0. nap 1. Egereket immunizáltunk az alábbi módon: bárány vért (/ 23) kaptunk hetente a Hylands Labs-tól. Aszeptikusán összegyűjtöttük; két térfoga trész Alserviers-hez egy térfogatrész vér. 2. 5-10 ml Alseviers-ben oldott bárány vért három ízben mostunk steril PBS-sel egy IEC klinikai centrifugában (2800 fordulat/perc; 10 perc; szobahőmérséklet). 3. A pelletet 1:10 arányban újraszuszpendáltuk steril PBS-ben. 4. Egy Z Coulter számlálót a Coulter Intruction Manual szerint kalibráltunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
