187324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok észter-származékainak előállítására
1 187 324 2 5. A számláláshoz 1 : 100 arányú hígítás szükséges, amit úgy készítettünk el, hogy először egy 1 : 100 arányú hígítást készítettünk PBS-sel, majd ezt az oldatot 1 : 10 arányban felhígítottuk izotóniás oldattal. A coulter számláló küszöbértékét # 5- re állítottuk be. 6. Meghatároztuk a sejtszámot, és a törzsoldatot 4* 107 sejt/'ml koncentrációjúra hígítottuk. Ezt a végső szuszpenziót használtuk fel az immunizáláshoz. 7. Az egereket az oldalsó farokvénába (a vénás tágulás érdekében 50 °C-os vízfürdőben melegítve) adott injektálással immunizáltuk 0,1 ml SRBC szuszpenzióval; az SRBC végső koncentrációja 4x 106/egér. f) Kezelés 1. Az egereket i. p. injektálással kezeltük a 0., 1., 2. és 3. napon. Az 1 cm3-es fecskendő egy 1-4),5 inches tűvel volt ellátva. A tűt 45°-os szögben szúrtuk be a linea alba jobb oldalába. A gyógyszerrel és a kontrollal kezelt csoportnak egyaránt 0,2 ml térfogatú oldatot adtunk be. 2. A gyógyszereket 0,2 ml térfogatban adtuk be a kívánt NPT 15 392 koncentrációban, ami egy 20 g-os egérnél 5 mikrogramm/ml. g) Lép kikészítés; 4. nap 1. A lépeket aszeptikusán eltávolítottuk és egyenként behelyeztük Falcon 2025 szövettenyészet csövekbe, amelyek 3 ml MEM-et tartalmaztak. A csöveket ezután jegelve tároltuk. 2. A lépeket ugyanabban a csőben egy teflon mozsártörővei homogenizáltuk, amely mozsártörő egy G. K. Heller-féle változtatható sebességű reverzibilis motorhoz volt kötve, amely viszont egy G. K. Heller-féle, GT-21 típusú motorszabályozóhoz csatlakozott (# 6 állás). 3. A homogenizálás idejét és módját minden mintára azonosnak választottuk. 4. A mintákat ezután átszűrtük egy 100 mesh (40 mikron) lyukméretű rozsdamentes acél szűrőn egy szabványos szövettenyészet csőbe. A szűrőt 3 ml MEM-mei öblítettük, és a sejtszuszpenziót jegelve tároltuk. 5. A Coulter számlálóban való sejtszámlálás céljára egy 1 : 1000 arányú hígítást készítettünk oly módon, hogy először PBS-sel készítettünk egy 1 : 100 arányú hígítást, majd izotóniás oldattal egy 1 ; 100 arányú hígítást. 6. A sejtszámot megkaptuk, és a szuszpenziót 1 x 107 sejt/ml értékre hígítottuk. A Coulter számláló küszöbértékét 10-re állítottuk be. A vörösvértesteket három csepp Zap izotóniás oldattal lízisnek vetettük alá. h) Fedőagar előállítása (0,7%) 1.0,35 g agarózt és 0,53 g MEM port bemértünk egy Erlenmeyer lombikba. A lombikhoz hozzáadtunk 50 ml desztillált vizet. 2. Az oldatot 15 percig tartottuk autoklávban körülbelül 125 °C-on és mintegy 10,35 kPa nyomáson. Ezt követően az oldatot 5 percre 45 °C-os vízfürdőbe állítottuk. A pH-t nátrium-hidrogénkarbonát hozzáadásával 7,2-re állítottuk be. 3. Egy ml-es alikvot részeket szétosztottunk 5 ml szövettenyészet csövekbe, melyeket előzőleg vízfürdőbe helyeztünk. Több tartalékcsövet is hagytunk. i) 10% -os SRBC oldat készítése 1. Öt m! bárány vért (ugyanezt a mintát használtuk az immunizáláshoz) egy 1EC klinikai standard centrifuga segítségével háromszor mostunk PBS- sel. A centrifugálást 10 percig végeztük A 4-es állásban (2800 fordulat/perc). 2. A harmadik mosás után a sejteket újraszuszpendáltuk PBS-ben, amelynek a térfogata tízszer akkora volt, mint a tömörített lemezek térfogata, azaz 0,5 ml tömörített SRBC-hez az 5 ml-es térfogat eléréséhez szükséges mennyiségű PBS-t adtunk. j) Bevonatok elkészítése 1. Agár lemezeket kivettünk a hűtőszekrényből, majd hagytuk szobahőmérsékletre felmelegedni őket. Mindegyik kísérleti csoport számára háromszoros sorozatban megjelöltük az agar lemezeket. 2. Az agarral töltött csöveket eltávolítottuk a vízfürdőről. Mindegyik agarral töltött csőhöz hozzáadtunk 0,1 ml 10%-os SRBC-t és 0,1 ml lépsejt szuszpenziót. A csöveket egy Vortex keverőn kevertük. 3. A csövek tartalmát azonnal ráöntöttük agar bázisú lemezekre, és a sima fázis kialakulásáig kavartuk. A lemezeket az agar megszilárdulásáig vízszintes felületre helyeztük. * 4. A lemezeket 90 percig inkubáltuk 37 °C-on 5% C02-ot és 95% levegőt tartalmazó nedves atmoszférában. 5. A tengerimalac komplementet (lásd d) fejezet) eltávolítottuk a fagyasztóból, felengedtettük szobahőmérsékletre, majd PBS-ben felhigítottuk 1 : 10 arányban. 6. A lemezeket kivettük az inkubátorból, és mindegyikhez hozzáadtunk 1 ml hígított komplementet. 7. A lemezeket ezután további 30-45 percig inkubáltuk 37 °C-on. Ezután a lemezeket kivettük az inkubátorból, majd rézsútos fény használatával számlálást végeztünk. 8. Adott esetben a lemezeket fordított helyzetben 4 °C-on tároltuk, majd 24 órával később ismételt számlálást végeztünk. A gyógyászati felhasználhatóság összefoglalása Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a standard szövettenyésztési technikákat használva gátolják az RNA vírusok reprezentatív mintáinak replikációját. Az RNA vírusok esetében úgy találtuk, hogy a hemadszorpciós technikát használva az A altípusba tartozó influenzavírus gátolva van. Az NPT 15 457 és NPT 15 458 sorozat több tagja 3,6-360 nanomól/ml koncentrációban gátolja az influenzavírus replikációját. A vírusok RNA osztályának egyéb tagjait a 6. táblázatban soroltuk fel, amelyek az ott megadott kórért felelősek. A világon ismert betegségek mintegy 25%-át okozzák a vírusok. Ezen túlmenően számos elkülönített vírusról bizonyosodott be, hogy rákkeltő. így várható, hogy a vírusölő szerek maguk is rendelkeznek daganatellenes, például leukémiaellenes tulajdonsággal. Meghatároztuk, hogy e szerek egyike, az NPT 15 458 milyen aktivitással rendelkezik az abnormá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
