187171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált aminoaciláz enzimkészítmény előállítására
1 187 171 2 Az aminosavak optikai izomerjei széles körben kerülnek felhasználásra, mint takarmánykiegészítők, gyógyszeripari alapanyagok, infúziós oldatok komponensei, illetve kozmetikai készítmények alkotórészei. Jelentőségük egyre növekszik. Előállításuk egyik útja a szintetikusan előállított racém elegy (D- és L-izomer 1 : 1 arányú elegye) enzimatikus szétválasztása aminoaciláz enzimekkel. Az aminoacilázok az élővilágban széles körben elterjedt hidrolitikus enzimek. Az általuk katalizált reakció általános egyenlete: R—CO—NH—GH(R')—COCT + H20 -> N-acil-aminosav víz-» R—COO“ + H2N—CH(R')—COOH zsírsav aminosav Az aminoacilázok jellemző tulajdonsága az aminosavak L optikai izontérjeivel szembeni nagyfokú specifikusság. Ennek révén, a racemát N-acil-származékának aminoacilázos kezelésekor csak az N- acil-L-aminosav szenved katalitikus hidrolízist, az N-acil-D-aminosav változatlan marad. A keletkező L-aminosav az N-acetil-D-aminosavtól egyszerű módon (kristályosítás, ioncserélő kromatográfia) elválasztható. Oldott aminoacilázok alkalmazása esetén, csak szakaszos eljárás valósítható meg, amelynek végén az enzim maga is szennyező anyagként jelentkezik a reakcióelegyben. Ezt a problémát azáltal hidalhatjuk át, hogy az enzimet valamilyen szilárd fázisú hordozó anyagon immobilizáljuk, tehát az eredetileg oldott állapotú katalizátort vízoldhatatlan formába visszük és így az a katalizált reakció végén egyszerű mechanikai művelettel (szűrés, centrifugálás) a reakcióelegyből eltávolítható, majd ismételten felhasználható. Az emlősvesékből (pontosabban sertésveséből) elkülönített, illetve mikrobiális eredetű aminoaciláz immobilizálására eddig már számos módszert ismertettek. A J. Am. Chem. Soc. 81, 4024 (1959) és Coll. Czech. Commun. 36, 2398 (1971) közlemények szerint az aminoacilázt ionos kötéssel rögzítik DEAE-cellulózhoz. Az aminoaciláz kovalens kötésekkel is immobilizálható. Az egyik ismert eljárás szerint hordozóként N,N'-metilén-bisz-akrilamiddal térhálósított akrilamid-metakrilát kopolimert használnak fel, ezt a kopolimert hidrazínnal kezelik, majd sósavas közegben nátriumnitrittel aktiválják, és az így előállított savazidhoz kapcsolják az enzimet (Macromolecules 4,350 [1971]). Egy másik ismert eljárásmód értelmében Enzacryl AA típusú hordozót (aromás aminocsoportokat tartalmazó poliakrilamid-származék) sósavas közegben nátriumnitrittel aktiválnak, majd az így nyert diazoszármazékhoz kapcsolják az enzimet (Coll. Czech. Commun. 38, 943 [1973]). Az ismert immobilizálási módszerek közös hátránya, hogy csekély fajlagos aktivitású terméket eredményeznek. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az aminoaciláz enzimből az ismerteknél két nagyságrenddel nagyobb fajlagos aktivitású enzimkészítményt állíthatunk elő, ha az enzimet Akrilex P típusú akrilamid-N,N'-metilén-bisz-akrilamid kopolimer részleges hidrolízisével kialakított hordozón immobilizáljuk. Amennyiben az Akrilex P típusú (Akrilex P-30, P -100, P-200), (Reanal Finomvegyszergyár) akrilamid-N,N'-metilén-bisz-akrilamid kopolimer gyöngyöket savval (például sósavval vagy egyéb erős savval) vagy lúggal (például nátriumhidroxiddal, nátriumkarbonáttal vagy egyéb erős bázissal) hidrolizáljuk, a —CO—NH2 csoportok körülbelül 50%-a alakul át karboxilcsoporttá, míg a —CO—NH2 csoportok fennmaradó része még erélyes reakciókörülmények között sem hasad fel. A hidrolizált kopolimerben tehát a karboxilcsoportok közé változatlan—CO—NH2 csoportok ékelődnek, amelyek kedvező térbeli helyzetben rögzítik a karboxilcsoportokat. Ha a kialakított karboxilcsoportokhoz önmagában ismert karbodiimides aktivitással aminoaciláz enzimet kapcsolunk, az immobilizált enzimmolekulák a karboxilcsoportok kedvező térbeli elhelyezkedése következtében nem gátolják egymás működését; így az immobilizált enzimkészítmény fajlagos aktivitása igen nagy érték. A találmány tárgya tehát eljárás aminoaciláz enzim immobilizálására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy Akrilex P típusú akrilamid-N,N'metilén-bisz-akrilamid kopolimerek savas vagy lúgos hidrolízisével kialakított, részlegesen hidrolizált kopolimert vízben oldható vagy 0 °C alatti hőmérsékleten szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyülettel kezelünk, az így aktivált hordozóra 6,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban aminoacilázt viszünk fel, a kapott terméket mossuk, végül kívánt esetben szárítjuk. A találmány szerinti eljárásban enzimként tetszés szerinti eredetű, bármilyen ismert módon elkülönített aminoacilázt felhasználhatunk. A részlegesen hidrolizált Akrilex P típusú kopolimer aktiválására karbodiimid-vegyületként például N-ciklohexíl-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot vagy N-etil-N'-(3- dimetil-amino)-propil-karbodiimidet használhatunk fel. Karbodiimid-vegyületekként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban azok a származékok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak. Az aktivált hordozóra 6,5 és 8,5 közötti pH-értékű - előnyösen 7,0 körüli pH-értékű - oldatból visszük fel az aminoacilázt. Az aminoacilázt célszerűen 0,1 mólos káliumfoszfát-puflferoidatban (pH = 7,0) oldott állapotban használjuk fel. A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzimkészítményt ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzimkészítmény azonban megfelelő stabilizálószerek - például nátriumazid - jelenlétében vizes szuszpenzióban is eltartható. A találmány szerinti eljárással előállított immobílizált enzimkészítmények fajlagos aktivitása 150-200 egység/mg xerogél, ami a Macromolecules 4, 350 (1971) szakcikkben ismertetett eljárással elérhető 0,55-2,24 egység/rag xerogél értékű aktivitással összehasonlítva legalább két nagyságrendnyi aktivitás-fokozódást jelent. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1
