187171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált aminoaciláz enzimkészítmény előállítására
1 187 171 2 Az új típusú immobilizált enzimkészítmények vizsgálata során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az immobilizálás hatására megnő az enzim stabilitása a lúgos pH-tartományban. Ez a jelenség rendkívül kedvező abban az esetben, ha az immobilizált enzimkészítményt DL-aminosavak rezolválására használjuk fel. Ismert, hogy a DL-aminosavak enzimes rezolválása 7,5 körüli pH-értéken megy végbe a legnagyobb sebességgel, és a pH csökkenésével párhuzamosan csökken a reakciósebesség. Minthogy a rezolválás előrehaladtával a reakcipelegy pH-ja minden esetben a savas tartományba tolódik el, a reakció sebessége időben folyamatosan csökken. Amennyiben a DL-aminosavak rezolválására a találmány szerint előállított új típusú, a lúgos pH-tartományban fokozott stabilitással rendelkező enzimkészítményt használjuk fel, a rezolválást a szokásosnál nagyobb pH-értékű elegyekkel indíthatjuk, és így kompenzálhatjuk a folyamatos pH-csökkenés reakciólassító hatását. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. /. példa 30 g Akrilex P-100 xerogélt 1 liter 1 n vizes nátriumhidroxid-oldatban szuszpendáltunk, majd a szuszpenziót 3 órán át 50 °C-on tartottuk. Ezután a duzzadt gélt 12 liter desztillált vízzel semlegesre mostuk, majd a mosást 10,5 liter 0,05 n vizes sósavoldattal folytattuk. Végül a gélt 30 liter desztillált vízzel mostuk. A kimosott gélt liofUizáltuk. 26 g enzimhordozót kaptunk, amelynek kötőkapacitása 6,14 milliekvivalens/g. 2. példa Az 1. példa szerint előállított xerogél 10 g-ját 500 ml káliumfoszfát-pufferoldatban (pH = 7,0) szuszpendáltuk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó keverés közben 20 g N-ciklohexil- N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonát 250 ml hideg ( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó keverés után a reakcióelegyhez 5 g sertésvese aminoaciláz 250 ml hideg ( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. A szuszpenziót 48 órán át + 4 "C-on kevertük, majd a gélt elválasztottuk, és háromszor 1 liter 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0), háromszor 1 liter 0,5 mólos nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0), majd háromszor 1 liter 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 2,5 liter desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 18 g immobilizált aminoaciláz. Aktivitás 158 //mól N- acetil-L-metionin hidrolízise/óra/mg szárazanyag. 3. példa » Az 1. példa szerint előállított xerogél 10 g-ját 500 ml 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban (pH = 7,0) szuszpendáltuk. majd jeges vízfürdőn, állandó keverés közben 10 g N-elil-N'-(3-dimetilamino)-propil-karbodiimid 250 ml hideg ( + 4 °C- os) pufferoldattal készített oldalát adtuk hozzá. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 5 g sertésvese aminoaciláz 250 ml hideg( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. A szuszpenziól 48 órán ál + 4 °C-on kevertük, majd a gélt elválasztottuk, és háromszor 1 liter 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal, háromszor 1 liter 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal. háromszor 1 liter 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0), végül négyszer 2,5 liter desztillált vízzel mostuk. A sómentesre mosott gélt liolilizáltuk. Kitermelés: 16 g immobilizált aminoaciláz. Aktivitás: 202 //mól N-acetil-L-metionin hidrolízise/óra/mg szárazanyag. 4. példa Az 1. példa szerint előállított xerogél 1 g-ját 50 ml káliumfoszfát-pufferoldatban (pH = 7,0) szuszpendáltuk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó keverés közben 2 g N-ciklohexil- N'-[2-(4-morfoliniI)-etil]-karbodiimid-metil-p-loluol-szulfonát 25 ml hideg ( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tarló keverés után a reakcióelegyhez 0,5 g, Aspergillus oryzaeből izolált, aminoaciláz 25 ml hideg ( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. A szuszpenziót 48 órán át +4 °C-on kevertük, majd a gélt elválasztottuk és háromszor 100 ml 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0), háromszor 100 ml 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0), majd háromszor 100 ml 0,1 mólos káliumfoszfátpufferoldattal (pH = 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 250 ml desztillált vízzel sómenlesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 1,6 g immobilizált enzim. Aktivitás: 1,05 //mól N-acetil-L-metionin hidrolízise/óra/mg szárazanyag. 5. példa 30 g Akrilex P-100 xerogélt 1 liter 1 n vizes sósavoldatban szuszpendáltunk, majd a szuszpenziót 5 órán át 100 “C-on tartottuk. Ezután a gélt 30 liter desztillált vízzel semlegesre mostuk, majd a kimosott gélt liofilizáltuk. 24 g enzimhordozót kaptunk, amelynek kötőkapacitása 4,25 milliekvivalens/g. 6. példa Az 5. példa szerint előállított xerogél 10 g-ját 500 ml^kálium-foszfát-pufferoldatban (pH = 7,0) szuszpendáltuk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó keverés közben 20 g N-ciklohexil- N'-(2-[4-morfolinil]-etil)-karbodiimid-metil-p-U>luol-szulfonát 250 ml hideg ( + 4 °C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó keverés után a reakcióelegyhez 5 g sertésvese aminoaciláz 5 1Ô 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
