187153. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált glükoamiláz enzim-készítmény előállítására
1 187 153 2 (pH 7,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,6 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 2,08 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 14. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferben (pH 7,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó keverés közben hozzáadtunk 1 g N-ciklo-hexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további keverés után a reakcióelegyhez 1,7 ml glükoamiláz oldatot (117,7 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés : 0,7 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 4,7 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. J. táblázat A reakcióelegy összetételének hatása a glükoamiláz enzim immobilizálására Akrilex C-100 hordozó alkalmazása esetén A reakcióelegy összetétele '•AC-100 2+CMC 5*GA (mg) (mg) (mg) S íS §1 E* =8 w VJ fcO a „5 rí i f ii' oES'sii gr •O « 8 3 £ $ 3 \3 •5 =5 .S .* ö O -a M < > < « ■ 500 500 125 0,6 75,7 24,3 1,32 500 500 250 0,5 56,1 43,4 2,08 500 1000 200 2,3 45,2 52,5 4,70 1* AC-100, Akrilex C-100 2* CMC, N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodiimidmetil-p-toluol-szulfonát 3* GA, glükoamiláz 15. példa 0,5 g Akrilex C-200 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 7,49 mekv/g, szemcsenagysága 120-320 pm volt, 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH 7,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó kevertetés közben hozzáadtunk 1,25 g N-ciklohexil-N'-[2-(4- morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további kevertetés után a reakcióelegyhez 2,6 ml glükoamiláz oldatot (120 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként 1 ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 100 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferrel (pH 7,5), háromszor 100 ml - 5 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), majd háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,7 g immobili- 10 zált glükoamiláz. Aktivitás: 7,5 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 16. példa 15 F 0,5 g Akrilex C-300 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 7,33 mekv/g, szemcsenagysága 40-120 pm volt, 150 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH 7,5) szuszpendál- 20 tunk, majd jeges vízfürdőn állandó kevertetés közben hozzáadtunk 1,2 g N-ciklohexil-N'-[2-(4- morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további kevertetés után a reakcióelegyhez 2,55 ml glükoamiláz oldatot (120 mg/ml) 2ö adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. 30 A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 150 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferrel (pH 7,5), háromszor 150 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), majd háromszor 150 ml 35 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,7 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás 8,4 g glükóz felszabadítása/ óra/g xerogél. 40 4. táblázat Glükoamiláz enzim immobilizálása 45 Hordozó Immobilizált aktiviás (%) Oldott állapotban visszanyert aktivitás (*) Aktivitásveszteség (%) A termék aktivitása (egység/g xerogél) Akrilex A 0,7 39,0 60,3 1,6 Akrilex C-100 4,3 45,3 50,4 5,7 Akrilex C-200 1,6 59,0 39,4 7,5 Akrilex C-300 1,8 69,5 28,7 8,4 55 15. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 5,8 mekv/g, szemcsenagysága 120-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos kálium- 00 foszfát oldatban (pH 7,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó kevertetés mellett hozzáadtunk 0,45 g N-etil-N'-[3-(dimetil-amino)-propil]karbodiimid-hidrokloridot. 10 perces további kevertetés után a reakcióelegyhez 2,5 ml glükoamiláz 6g oldatot (117,2 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy 6
