187153. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált glükoamiláz enzim-készítmény előállítására
1 .187 153 2 C-200 és Akrilex C-300 kereskedelmi nevű polimerek kizárási molekulasúlya rendre 100 000, 200 000, illetve 300 000 dalton. Polimerként előnyösen alkalmazhatunk továbbá akrilamid - N,N'metilén-bisz-akrilamid - N-(amino-etil)-akrilamid kopolímereket (Akrilex A típusú polimereket) is. A találmány szeriti eljárásban enzimként tetszés szerinti eredetű, bármilyen ismert módon elkülönített glükoamiláz enzimet felhasználhatunk. Aktiváló karbodiimid vegyüleként például N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot vagy N-etil-N'-[3- (dimetil-amino)-propil]-karbodiimid-hidrokIoridot használhatunk fel. Karbodiimid vegyületekként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerben oldható karbodiimid vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban csak azok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak. A hordozókra 4,5 és 9,0 közötti pH-értékű - előnyösen pH 7,5-ös - oldatból visszük fel a glükoamilázt, illetve O-acil-izokarbamid származékát. A reakció közegéül célszerűen 0,1 mólos káliumfoszfát pufiferoldat vagy 0,1 mólos nátrium-acetátoldat szolgál, amelynek pH-ja 7,0-7,5. A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzim-készítményeket ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzim-készítményeket - 0-4 °C-on - vizes szuszpenzióban is eltarthatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított, immobilizált enzim-készítmények aktivitása 0,9-8,4 egység/g xerogél, ami a gyakorlati felhasználás szempontjából igen kedvezőnek tekinthető. (Egy egység az az enzimmennyiség, amely 1 gramm glükóz felszabadulását katalizálja oldható keményítőből, pH 4,0-nél, 60 °C-on.) Az eljárásunkkal akrilamid-N,N'-metilén-biszakrilamid-akrilsav kopolimeren (Akrilex C— 100) immobilizált glükoamiláz széles pH-tartományban nagyobb vagy közel azonos stabilitást mutat, mint az oldható enzim (vö. 1. táblázat). 1. Táblázat Glükoamiláz enzim-készítmények höinaktiválódásának félideje (t,J 60 °C-on Az inkubálás pH-ja Inaktiválódási félidő (tM) (perc) Oldott glükoamiláz Immobilizált glükoamiláz 3,0 32 80 3,5 124 113 4,0 133 280 4,5 105 130 5,0 44 42 5,5 15 15 Szubsztrát jelenlétében, az alkalmazás optimális pH-ján ez a hatás még kifejezettebb. A találmány szerinti eljárásokat az oltalmi kör korlátozása nélkül, az alábbi példákon részletesen ismertetjük. 0,5 g Akrilex A típusú xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—NH2-tartalma) 2,75 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 25 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd 0 °C-on - állandó kevertetés mellett - 1,7 ml glükoamiláz-oldatot (117,7 mg/ml) adtunk hozzá, 10 perc kevertetés után a reakcióelegyhez 25 ml hideg ( + 4 °C) pufferben oldott, 0,5 g N-ciklohexil- N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot adtunk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C- on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a reakcióelegyet. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferrel (pH 7,0), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos káliumfoszfát pufferrel (pH 7,0), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,0) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,6 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 1,6 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 2. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát pufferben (pH 4,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó kevertetés mellett hozzáadtunk 1 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további kevertetés után a reakcióelegyhez 1,7 ml glükoamiláz oldatot (117,7 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 4,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH 4,5), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH 4,5), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos nátriumacetát pufferrel (pH 4,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,7 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 0,85 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. /. példa 3. példa A 2. példában ismertetett technológia szerint jártunk el, csupán azzal a különbséggel, hogy a reakciót 24 óra alatt játszattuk le. Kitermelés: 0,65 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 0,79 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 4. példa Mindenben a 2. példában leírt eljárást alkalmaztuk, csak a reakcióidő tartamát emeltük 72 órára. Kitermelés : 0,63 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 0,82 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. . 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
