187153. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált glükoamiláz enzim-készítmény előállítására
1 187 153 2 A találmány tárgya eljárás glükoamiláz enzim xerogéleken történő immobilizálására. A növényi szervezetek fotoszintetikus tevékenysége során keletkező szerves anyagok közül a keményítő igen fontos ipari nyersanyag. Napjainkban előtérbe kerültek enzimatikus átalakításai, illetve azok ipari méretű megvalósítása. Eiek közül az egyik legfontosabb a glükózzá történő hidrolízis, amelynél rendszerint savval vagy a-amilázzal részlegesen hidrolizált keményítőt kezelnek glükoamiláz enzimmel. A glükoamiláz a dextrinek nemredukáló végéről hasítja le a glükóz egységeket. Oldott glükoamiláz alkalmazása esetén csak szakaszos vagy félfolyamatos eljárások valósíthatók meg, és a reakció végén az oldott enzim aktív formában történő elválasztására gazdaságos lehetőség nincs. Ezért már az 1960-as évek végén megkísérelték az enzim immobilizálását úgy, hogy az enzimet dietil-amino-etil-cellulózhoz kapcsolták 2-amino- 4,6-diklór-s-triazin segítségével [Biotech. Bioeng. //, 349 (1969)]. Azóta számos egyéb eljárás is ismeretes. A Biotech. Bioeng. 12, 85 (1970); Biotech. Bioeng. 23, 2273 (1981) és az Ann. Technoi. Agric. 27, 469 (1978) közlemények szerint az enzim eredményesen immobilizálható ionos kötéseken keresztül, hordozóként DEAE-cellulózt, metil-metakrilát-2-dimetil-aminoetiI-metakrilát kopolimeren, illetve Amberlite IRA 93-on. Üveg illetve szilíciumdioxid alapú hordozókon történő immobilizálását ismerteti a Biotech. Bioeng. Symp. 3, 241 (1972); Biotech. Bioeng. 15, 483 (1973); Biotech. Bioeng. 18, 253 (1976); Prikl. Biohim. Mikrobiol. 15, 744 (1979); Enzyme Microb. Technoi. 1, 197 (1979); Biotech. Bioeng. 23, 2083 (1981); Enzyme Microb. Technoi. 4, 89 (1982) és az Enzyme Microb. Technoi. 4, 107 (1982) közlemények, valamint a 3 783 101 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Poliszacharid (elsősorban cellulóz) alapú hordozókon történő immobilizálás módszerét ismerhetjük meg a Biochim. Biophys. Acta 276, 339 (1972); Biochim. Biophys. Acta 341, 457 (1974); Acta bioi. med. germ. 36, 179 (1977); Starch/Stärke 30, 414 (1978); Prikl. Biochim. Mikrobiol. 14, 548 (1978) és a Collection Czechoslov. Chem. Commun. 45, 2847 (1980) közleményekből, valamint a 3 810 821 sz., 4 063 017 sz. és a 4 Ó90 022 sz., továbbá a 4 048 416 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokból. Szintetikus polimerek használhatók a glükoamiláz immobilizálásához a J. Jap. Soc. Starch Sei 24, 1 (1977); Int. J. Biochem. 8, 501 (1977); Biotech. Bioeng. 20, 1319 (1978) és az Enzyme Microb. Technoi. 4, 143 (1982) közlemények, továbbá a 4 066 504 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint. Az ismert eljárások hátrányai vagy a különleges, nehezen hozzáférhető hordozók, vagy bonyolult kapcsolási eljárások használata, és nem utolsó sorban az immobilizált enzim csökkent stabilitása. A találmány célja a fenti hiányosságok kiküszöbölésével olyan immobilizált glükoamiláz készítmények előállítása, amelyek tartós felhasználásra alkalmasak, melyek az enzimet kémiailag inert, mikroorganizmusok hatásának korlátlanul ellenálló, jó mechanikai tulajdonságokkal rendelkező, nagy átfolyási sebességet biztositó hordozóhoz kötött állapotban tartalmazzák. Ezen felül célja még a találmány szerinti megoldásnak az is, hogy az immobilizálásra szoruló enzimnek a hordozóhoz való kapcsolása kémiailag és fizikailag egyaránt enyhe körülmények között történjék. Kísérleteink tanúsága szerint, az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomerekből, illetve N-aminoetil-akrilamid és/vagy N-aminoetil-metakrilamid monomerekből ismert módon akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel (így N,N'-metiIén-bisz-akrilamiddal, etiléndiakriláttal vagy N,N'-diallil-borkősavamiddal) felépített, legalább 1,0 mekv/g, célszerűen 2-8 mekv/g —COOH vagy —NH2 funkciós csoportot tartalmazó polimerek teljes mértékben kielégítik a hordozókkal szemben támasztott követelményeket. Primer aminocsoportokat tartalmazó hordozók alkalmazása esetén, az enzim egyes aszpartil- vagy glutamil-oldalláncainak karboxil-csoportjait karbodiimides kezeléssel O-acil-izokarbamid származékká alakítjuk át és ez lép reakcióba a hordozón elhelyezkedő amino-csoportokkal. Karboxil funkciós csoportokkal rendelkező polimer hordozók alkalmazásánál a karboxilcsoportokat az önmagában ismert karbodiimides aktiválással aktiváljuk és így alkalmassá válnak a glükoamiláz enzim megkötésére. A karbodiimidek aktiválószerként való használata azért előnyös, mert az aktiválási reakció enyhe körülmények (0-4 °C ; pH 6,0-8,0) között is végrehajtható. A találmány tárgya tehát eljárás immobilizált glükoamiláz enzim-készítmény előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy 1. a glükoamiláz enzimet vízben oldható vagy 0 °C alatti hőmérsékleteken szerves oldószerekben oldható karbodiimid vegyülettel kezeljük és az így kezelt enzimet 4,5 és 9,0 közötti pH-értékű oldatban N-amino-etil-akrilamid és/vagy N-amino-etilmetakrilamid, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomerekből akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel felépített, legalább 1,0 mekv/g —NH2-csoportot tartalmazó polimerre visszük fel, vagy 2. az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomerekből akrilvagy allil-típusú térhálósítószerrel felépített, legalább 1,0 mekv/g—COOH funkciós csoportot tartalmazó polimert vízben oldható vagy 0 °C alatti hőmérsékleteken szerves oldószerekben oldható karbodiimid vegyülettel kezeljük, az így aktivált hordozóra 4,5 és 9,0 közötti pH-értékű oldatban glükoamiláz enzimet viszünk fel. Mindkét esetben a kapott terméket kiszűrjük, mossuk, végül a terméket kívánt esetben szárítjuk. Polimerként különösen előnyösen használhatunk fel olyan akrilamid - N,N'-metilén-bisz-akrilamid - akrilsav kopolimereket (Akrilex C típusú polimereket), amelyek kizárási molekulasúlyhatára 100 000 daltont meghaladó érték. A kizárási molekulasúlyhatáron azt a maximális molekulasúlyt értjük, amelynél nagyobb molekulasúlyú anyagok már nem képesek a gélszemcsék belsejébe hatolni. A példákban említett Akrilex C-100, Akrilex 5 ^0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
