186976. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glükóztartalmának meghatározására és az eljárás kivitelezésére szolgáló reagens-kittek
6 186976 7 frakciót négyszer mostuk. A hemolizáló és a mosóoldat a J. Physiol. 235, 551 (1973) közleményének megfelelően készült. Az így nyert hemoglobinmentes membránból fehérjemeghatározást végeztünk és a membránszuszpenzió koncentrációját 2,5 mg/ml fehérjének megfelelő értékre állítottuk be. Ezután 2,5 ml membránfrakcióhoz 2 ml 0,1%-os nátrium-dodecilszulfátot és 1 ml 1 n oxálsavat adtunk és 2,5 órán át, 112—115 °C- on, nyomás alatt hőkezeltük. A hidrolizátumhoz 1 ml 20%-os szulfoszalicilsav-oldatot adtunk, amelynek hőmérséklete 40 °C volt, majd a keletkező szuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszó fényelnyelését 398 nm-nél leolvastuk (Elérték), majd 2 ml-éhez 0,5 ml 0,05 mólos barbitursav-oldatot adtunk és az elegyet 40 percig 40 °C-on inkubáltuk. Ezután az elegyet lehűtöttük és 10 percen belül leolvastuk fényelnyelését 398 nm-nél egy membránfrakció nélkül készített vak oldat ellenében (Ej-érték). A glukóztartalom (G) kiszámítása az alábbi képlettel történt: G=2,40 E2(JM)—0,8 E^gjg)—0,20 100 mg fehérje (F) X10 2 mól glukóz/ ahol (F) a membránfehérje koncentrációja mg/ml-ben. A konstans tartalmazza a barbitursav-származék moláris extinkciós koefficiensét, valamint a savas lebontás során bekövetkező 5-hidroxi-metil-furfural veszteség korrekciós faktorát és a hígítást is. b) A fehérje előkészítése és a glukózmeghatározás az aj-ban leírt módon történt, csak a cukorszármazék meghatározásához 0,5 ml 0,05 mólos tiobarbitursavat használtunk. A reakciót 360, illetve 443 nm-nél követtük. A mérés kiértékeléséhez a hullámhossztól függően az alábbi képleteket használtuk: G =1,05 100 mg fehérje illetve mól glukóz/ G= 1,50 E2(iia)—0,5 Ed.ua)—0,14 100 mg fehérje (F) X10 2 mól glukóz/ 3. példa Plazmafehérjék glikoziláltságának meghatározása A vérből elválasztottuk a plazmát. A vérplazma fehérjetartalmát meghatároztuk és fehérjekoncentrációját 10 mg/ml-re állítottuk be. Ezután 2 ml-éhez 1 ml 1 n oxálsav-oldatot adtunk és 2,5 órán át, 112—115 “Cion, nyomás alatt hőkezeltük. A hidrolizátumhoz cseppenként 1 ml 0,6 mólos triklórecetsav vizes oldatát adtuk, majd a keletkező szuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszó fényelnyelését 398 nm-nél leolvastuk (Elérték), majd 2 ml-éhez 0,5 ml 0,05 mólos barbitursav-oldatot adtunk és az elegyet 40 percig 40 °C-on inkubáltuk. Ezután az elegyet lehűtöttük és 10 percen belül leolvastuk fényelnyelését 398 nm-nél egy plazmafehérje nélkül készített vak oldat ellenében (E2-érték). A glukóztartalom (G) kiszámítása az 1. példa aj-ban közöltek szerint történt. Plazmafehérjék meghatározásánál is használható a lehasadt glukóz-származék meghatározására a tiobarbitursavas reakció. Ebben az esetben 0,5 ml 0,05 mólos tiobarbitursavat adtunk a felülúszó 2 ml-éhez. A kiér- 5 tékeléshez az extinkcióértékeket 443 nm-nél olvastuk le és a fentiekben már ismertetett képletet használtuk a kiértékeléshez. 10 4. példa Nem-enzimatikusan glikozilált albumin glukóztartalmának meghatározása 15 A vérből centrifugálással elválasztottuk a plazmát. A plazma pH-ját pH=6,9-re állítottuk 2 mólos sósavoldattal. Ezután — keverés közben — 15%-nyi poli(etilén-glikol)-t csepegtettünk bele (50%-os vizes oldatot használtunk) és 20 percig keverteètük. A szusz- 20 penziót centrifugáltuk és a felülúszó pH-ját pH=4,6- ra állítottuk. További 9%-nyi szilárd poli-(etilén-glikol)-t adtunk hozzá kb. 1 óra alatt és további 30 percig kevertettük. A csapadékot centrifugálással elválasztottuk, majd néhány csepp desztillált vízben feloldot- 25 tűk. Az oldatot egy acetát pufferrel (pH=5,2) egyensúlyba hozott, 20X1,6 cm-es QAE-Sephadex oszlopra vittük fel és a poli-(etilén-glikol)-t mosással eltávolítottuk, majd olyan acetát pufferrel eluáltuk az albumint, amelynek pH-ja 4,8 volt. Meghatároztuk az albumin- 30 oldat fehérjetartalmát és 2 ml-éhez 1 ml 1 n oxálsavoldatot adtunk. Ezután az elegyet 2,5 órán keresztül, 112—115 °C-on, nyomás alatt hőkezeltük. A hidrolizátumhoz 1 ml 20%-os szulfoszalicilsav 40 °C-os oldatát adtuk, majd a keletkező szuszpenziót centrifugál- 35 tűk, a felülúszó fényelnyelését 398 nm-nél leolvastuk (Erérték), majd 2 ml-éhez 0,5 ml 0,05 mólos barbitursav-oldatot adtunk és 40 percig 40 °C-on inkubáltuk. Ezután az elegyet lehűtöttük és 10 percen belül leolvastuk fényelnyelését 398 nm-nél egy albumin nélkül 40 készített vak oldat ellenében (E2-érték). A glukóztartalom (G) kiszámítása az alábbi képlettel történt: G=2,40 io-, m0l glukóz/ 100 mg albumin ahol (A) az albumin koncentrációja mg/ml-ben. A konstans tartalmazza a barbitursav-származék moláris extinkciós koefficiensét, valamint a savas lebontás bo- 50 rán bekövetkező 5-hidroxi-metil-furfural veszteség korrekciós faktorát és a hígítást is. 5. példa 55 Immunoglobulinok glikoziláltságának meghatározása Az alvadásgátolt vérből elválasztottuk a plazmát, 00 majd az immunoglobulinokat rivanolos kicsapás után QAE-Sephadex kromatográfiával tisztítottuk. 2 ml 5%-os immunoglobulin oldathoz 1 ml savkeveréket (1 n oxálsav + 1 n ecetsav vagy 1 n oxálsav -f 1 n kénsav) adtunk. A hidrolízist 100 °C-on 1 óra hosz-4
