186976. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glükóztartalmának meghatározására és az eljárás kivitelezésére szolgáló reagens-kittek
8 186976 9 szat végeztük, majd a fehérjét 1 ml 0,6 mólos szulfoszilicilsavval kicsaptuk. A keletkező csapadékot 1500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk és a felülúszó 2 ml-éhez 0,5 ml 0,054 mólos rezorcin, 2X 10~3 M CuS04 oldatot adtunk. (A reagensek hozzáadása előtt meghatároztuk a felülúszó kiindulási fényelnyelését 405 nmen (Ej). [A reakcióelegyet 15 percig 100 °C-on hevítettük. Lehűtés után ismét mértük a fényelnyelést 405 nm-nél (E2).] Glukóztartalom (G) = = 37,6 (Ej—Ej—0,1) mol/100 mól 6. példa Hemoglobin glikoziláltságának meghatározása Fiziológiás sóoldattal mosott vörösvérsejt 1 ml-éhez 2 ml 0,1%-os Na-dodecilszulfátot adtunk. Meghatároztuk a hemolizátum koncentrációját (Hb), majd 2 miéhez 1 ml 1 n oxálsav-10~4 mólos HgCl2 oldatot adtunk és 1 órán át 100 °C-on tartottuk. A fehérjét 1 ml 20%os szulfoszalicilsavval csaptuk ki és centrifugálással távolítottak el. A felülúszó extinkcióját 443 nm-nél meghatározva (Ej) 2 ml-éhez 0,5 ml 0,05 mólos tiobarbitursavat adtunk. 40 °C-on történő 40 perces inkubálás után az extinkciót újra meghatároztuk (E2). Ej—Ej X 0,8—0,1 Hb (mol/Í) X10 2 mol/100 mól 7. példa Gyors eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott hemoglobin glukóztartalmának meghatározására alacsony hőmérsékleten Heparinnal alvadásgátolt vért fiziológiás sóoldattal addig mosunk, míg a felülúszó fehérjementes lesz. 1 ml mosott vörösvérsejtét 2 ml 0,1%-os Na-dodecilszulfát oldattal kétszer lefagyasztunk és felengedünk. A keletkezett hemoglobin oldat koncentrációját meghatározzuk, majd 2 ml oldathoz 1 ml 0,3 n kénsavat és 0,1 ml 10~4 mólos HgClj oldatot adunk és az elegyet 30 percig 40 °C-on tartjuk. Az oldat fehérjetartalmát 1 ml 0,6 mólos szulfoszalicil-savval kicsapjuk, a keletkezett csapadékot 1500 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugálva eltávolítjuk. A tiszta felülúszó fényelnyelését 443 nm-nél meghatározzuk (Ex). Az oldat 2 miéhez 0,5 ml 0,05 mólos tiokarbitursav oldatot adunk az oldatot további 40 percig 40 °C-ra helyezzük. A fényelnyelést az oldat lehűtése után 10 percen belül ismét meghatározzuk 443 nm-nél (E2). Glukóztartalom : G= 1,38 — 5Íj~(moI/Í%~~ 10-2 mól glukóz/100 mól Hb 8. példa Hemoglobin glikoziláltságának meghatározása Eiziológiás sóoldattal háromszor mostuk a vörös vér - sejteket, majd az üledék 2 ml-éhez 3,5 ml 0,1%-os nátrium-dodecil-szulfát oldatot adtunk. Meghatároztuk a hemoglobin-koncentrációt, és a hemolizátum hemoglobin-koncentrációját (Hb%) desztillált vízzel való hígítással 9,0 és 11,0 g/100 ml közötti értékre állítottuk be. Ezután a hemolizátum 3,0 ml-éhez 1,5 ml kénsavg -arzenát oldatot (0,3 normál kénsav oldatban oldott 0,01 mól dinátrium-hidrogén-arzenát) adtunk, az elegyet összeráztuk, és egy órán át forrásban lévő vízfürdőn inkubáltuk. Ezután az oldatot 30—40 °C-ra lehűtöttiik és cseppenként 1,5 ml 40%-os triklórecetsavjQ oldatot adtunk hozzá, miközben az elegyet vibrátorral kevertük. Az oldatot szűrtük, és a szőriét 2,0 ml-éhez 0,5 ml 0,025 mólos tiobarbitursav-oldatot (oldószer 0,01normál nátriumhidroxid-oldat) adtunk. Az elegyet összekevertük, 40 percig 40 °C-on inkubáltuk, majd jg 20 °C-ra lehűtöttük. A minta fényelnyelését (E) 30 percen belül 443 nm-en leolvastuk. A mért értékekből a következőképpen számítottuk ki a glikozilált hemoglobin (HbA)Ie mennyiségét : XTV A o/ E 20 HbAi<” %= 0,006 xHb, % Szabadalmi igénypontok 25 1. Eljárás nem enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glukóztartalmának meghatározására savas hőkezeléssel hidroximetil-furfural kialakítása, a fehérje lecsapása, majd a hidroximetil-furfurallal történő szín-3Q képzés útján, azzal jellemezve, hogy a sejtbe zárt vagy vízold hatatlan fehérjéket ionos vagy nemionos detergens segítségével oldatba visszük, a glukózt túlnyomás alatt legalább 1 n sav felhasználásával, előnyösen katalizátor jelenlétében 5-hidroximetil-furfural gg alakjában leválasztjuk, majd a reakcióelegyet fehérjementesi’tjük, ezt követően az 5-hidroximetil-furfuralt valamely, kiterjedt kettős kötés rendszer kialakítása révén ezzel színes terméket képező szerves vegyülettel kondenzáltatjuk, végül a kapott termék koncentráció- 40 ját spektrofotometriásán meghatározzuk. (Elsőbbség: 1982. október 1.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként nátrium-dodecilszulfátot használunk. (Elsőbbség: 1982. október 1.) 4 - 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1-lemezv e, hogy a savas hidrolízist 0,12—0,2, célszerűen 0,15—0,17 MPa nyomáson oxálsav-oldattal végezzük. (Elsőbbség: 1982. október 1.) 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1- g0 lemezve, hogy a savas hidrolízist katalizátor, előnyösen higany (Il)-klorid jelenlétében végezzük. (Elsőbbség: 1982. december 8.) 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1- lemezve, hogy a savas hidrolízist katalizátor, előgg nyösen dinátrium-hidrogén-arzenát jelenlétében végezzük. (Elsőbbség: 1985. február 13.) 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1- 1 e m e z v e, hogy a savas hidrolízist savkeverékkel végezzük. (Elsőbbség: 1982. december 8.) QQ 7. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a fehérjementesítéshez szulfoszalicilsavat alkalmazunk. (Elsőbbség: 1982. október 1.) 8. Az l—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5
