186839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás újszülött borjúban, csikóban vagy tehén vagy kanca kolosztrumában jelenlévő IGG mennyiségének meghatározására
1 186839 2 200 és 400 mg/dl között kérdéses, hogy szükséges-e a terápia; és 400 mg/dl fölötti koncentráció kielégítő. Az igényelt eljárás ezeknek a koncentrációknak egyszerű mérését lehetővé teszi. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott latexrészecskék bármilyen, alkalmas, biológiailag közömbös részecskék lehetnek. Alkalmas részecskék például a poli/vinil-toluol), a sztirol-buiadién-latex, sztirol-/divinil-benzol)-latex, akril-latex és a polisztirol-latex. A latexrészecskék mérete 0,109 és 0,81 pm között váltakozhat. Ilyen latexrészecskék beszerezhetők például a következő cégektől: Dow Chemical Co. (Midland, Michigan, USA); Monsanto and Co. (St. Louis Missouri, USA); Rhone-Poulenc (Párizs, Franciaország); és AB Bofors (Örebro, Svédország). A latexrészecskék a kereskedelmi forgalomból szuszpenziók — például 10 súly/térfogat-%-os vizes latex-szuszpenzió — alakjában szerezhető be, és megfelelő puffer oldattal hígíthatók. Alkalmasak az olyan pufferok, amelyek vízben megfelelően oldódnak, és körülbelül 7,5—9 pH-értéken nagy pufferkapacitással rendelkeznek. Alkalmas puffer például a borát és fiziológiai konyhasóoldat elegye, a glicin és fiziológiai konyhasóoldat elegye, valamint az N,N-bisz(2-hidroxi-etil/-glicin. Megfelelő borát-puffer például 12,2 millimól Na2B407-ból 7,1 millimól HCl/ml elegyítésével kapható. Ehhez a borátoldathoz 0,08—10 súly/térfogatszázalék konyhasóoldatot adunk. Előnyös a 0,3—1,25 sülyszázalékos oldat alkalmazása. Kívánt esetben a borátból és fiziológiai konyhasóoldatból álló puffert előállíthatjuk úgy, hogy 50 ml 0,1 mólos bórsavat és 5,9 ml 0,1 n nátronlúgot elegyítünk, vízzel 100 ml-re töltjük, és körülbelül 8,2 pH-értékre állítjuk, majd a pufferoldat 100 ml térfogatára számítva 0,85 g nátrium-kloridot adunk hozzá. Glicint és fiziológiai konyhasóoldatot tartalmazó, megfelelő pufferoldat 0,1 mólos, pH-értéke 8,2, és literenként 10 g nátrium-kloridot tartalmaz. A latexrészecskéket körülbelül 7,5—90 pH-érték mellett 0,65—2 súly/térfogat-százalék végkoncentrációra hígítjuk. A testfolyadék egy újszülött csikó vagy borjú vérplazmája, vérszéruma vagy teljesvére lehet, vagy egy kanca vagy tehén kolosztrumából származhat. A testfolyadékot a fentebb említett pufferek egyikével úgy hígítjuk, hogy a testfolyadék térfogatrészeinek a pufferoldat térfogatrészeihez való aránya 0,01:12 és 0,01:2160 között legyen. A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a részecskenagyságú 0,109—0,81 pm mérettartományra való korlátozása lényeges. A latexrészecskék méretének csökkenésével a fajlagos felület lényegesen megnő, és ennek következtében az agglutináció kimutatása nehézkessé válik. Ha a latexrészecskék mérete növekszik, akkor a fajlagos felület lényegesen csökken. Ugyanez a megfontolás érvényes a latexrészecskék mennyiségének 0,65—2,0 súlyszázalék koncentrációtartományra való korlátozására is. Ha a latexrészecskék koncentrációja a 2,0 súlyszázalékot meghaladja, akkor az IgG meghatározása nem hajtható végre, mert az IgG-ből túlságosan nagy mennyiség szükséges. Ha a latexrészecskék koncentrációja 0,65 súlyszázalék alá csökken, akkor viszont az agglutináció kimutatása fokozódóan nehézkessé válik. A fentebb említett latexméretek és -koncentrációk alkalmazása során megállapítottuk, hogy a vizsgálandó testfolyadék úgy hígítható, hogy a testfolyadék térfogatrészeinek a puffer térfogatrészeihez viszonyított aránya 0,01:12-től 0,01:2160 tartományban legyen. Ha a testfolyadékot úgy hígítjuk, hogy a pufferhoz viszonyított aránya 0,01:2160-nál kisebb, akkor ez a kívántnál nagyobb méretű részecskéket igényelne ahhoz, hogy azonos IgG koncentráción belül agglutinálót idézzen elő, ás ennek következtében egy ilyen rendszerrel dolgozni nehézkes lenne. Ha a testfolyadék a pufferoldathoz viszonyítva 0,01:12 aránynál koncentráltabb, akkor a latexrészecskék valamennyi, fentebb említett mérete mellett már jelentéktelen IgG- kcncentrációk jelenlétében is bekövetkezik az agglutináció. A latex és a szérum megfelelő pufferoldattal való helyes hígítását a szakember az alábbiakban következő leírás szerint könnyen meghatározhatja. A találmány egyik előnyös kiviteli formája szerint 0,22 fim méretű latexrészecskéket 2,0 súlyszázalék végkoncentrádóra hígítunk. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákban részletesen ismertetjük, a latex-oldatokat — ha külön megjegyzést nem teszünk — a Dow Chemicai Co. cégtől szereztük be. Kontrolleljárás Újszülött csikóktól születésük után mintegy 6—8 órával szérummintákat vettünk. A radiál-immundiffúziós vizsgáló készletet („RID”) (ezt a Miles Laboratories Inc. cégtől (Elkhart, Indiana, USA) szereztük be] a következő módon alkalmaztuk. A készlet pufféról; agarózba ágyazott ló-IgG antitestet (ellenanyagot) tartalmazott. Az agarózba lyukak voltak kiképezve. A mérendő szérumnak kiválasztott standard mennyiségét egy lyukba töltöttük, a standard kontrollmintákat pedig a többi lyukba helyeztük. A szérumot és az agarózt szobahőmérsékleten körülbelül 16—24 órán át inkubáltuk. Minden egyes lyuk körül csapadékgyűrű képződött, mégpedig a jelenlevő IgG mennyiségével arányosan. E gyűrűk átmérőjét megmértük, és a koncentrációtól való függésben fél-logaritmikus papíron görbével ábrázoltuk. A szérummintákban levő IgG mennyiségét ezen az alapon határoztuk meg. 1. példa 10 súly/térfogat-%-os 0,22 pm méretű részecskéket tartalmazó polisztirol-latex-oldatot 1:5 térfogat/térfogat arányban 0,2 mólos, 8,5 pH-értékű N,N-bisz(2- -hidroxi-etil)-glicin pufferoldattal körülbelül 2 súly/térfogat-% végkoncentrációra hígítottunk. Minden egyes vizsgálatra duplikátumban alkalmaztuk a csikó-szérummintákat, ugyanúgy, mint a kontrolleljárás során. Egy sorozatvizsgálattal megállapítottuk, hogy az IgG-koncentrációk egyszerű meghatározása lehetséges, ha a szükséges szérummennyiség 4—6 cseppnél nem több. E kísérleteink alapján 5 p\ csikó-szérumot adtunk 8 ml N,N-bisz(2-hidroxi-etil)-gli cin pufferoldathoz (0,2 mólos, pH-értéke 8,5), és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
