186839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás újszülött borjúban, csikóban vagy tehén vagy kanca kolosztrumában jelenlévő IGG mennyiségének meghatározására
1 186839 A találmány tágya eljárás IgG mennyiségének meghatározására újszülött borjúban, csikóban vagy tehén vagy kanca kolosztrumában. Az újszülött emberek vagy állatok immunglobulinokra — azaz antitestekre — már születésük előtt a placenta válaszfalán át szert tesznek. Elsősorban ezeknek az immunglobulinoknak a jelenlétében alakul ki az újszülöttben az antitesteknek egy megfelelő szintje (koncentrációja), amely az újszülöttet fertőző betegségekkel szemben ellenállóvá teszi. Ezeknek az immunglobulinoknak egyik típusa, az IgG már igen korán, egy immunogén stimulus hatására fellép, és — elsősorban az erek útján való eloszlással — az első védelmi rendszert jelenti. Ezzel ellentétben a csikók és borjúk a placenta leválásáig gyakorlatilag nem rendelkeznek IgG-vel, és ezért születésükkor csak extrém alacsony IgG szinttel (koncentrációval) rendelkeznek; ezt az állapotot hipogammaglobulinémiának nevezik. Ez a helyzet általában az IgG-ben dús kolosztrum felvételével, és ennek a bél epitéliumán át való felszívódása következtében változik meg. Az emlősöknek az IgG-t születésük után megközelítőleg 24 órán belül abszorbeálniuk kell, mert ennek az időnek az eltelte után az IgG a bélrendszerben már nem szívódik fel. A kolosztrum IgG-tartalmának felszívódása csikók és borjak egészségvédelme szempontjából ezek újszülött korában igen lényeges. Ha nem szívódik fel elegendő mennyiségű IgG, akkor ez egyike azon fő tényezőknek, amelyek következtében az egyébként normális csikók fertőzések áldozatává válnak, és elhullanak [J. Am. Vet. Med. Áss., 166, 71 (1975)]. Ha az IgG átvitele nem történik meg, akkor ezt gyorsan és pontosan fel kell ismerni (diagnosztizálni), hogy eldönthető legyen, vajon terápiás megoldás lehetséges-e, vagy az állatról le kell-e mondani. Ez a terápia IgG befecskendezésében állhat. Számos közlemény foglalkozik az immunglobulinnak „latex-flokkulációs vizsgálat” útján való meghatározásával: ez polisztirol-latex részecskék pelyhes formában való kicsapódását (flokkulációját) jelenti. E vizsgálat során a latexrészecskéket általában egy antigén anyaggal — például hormonokkal vagy vérfehérjékkel, amilyen az albumin vagy az immunglobulin, például az IgG és IgM — vonjuk be. A latexrészecskék negatívan töltöttek, és a fehérjét adszorpció jelenség útján megkötik. A második lépésben egy második reagenst adunk a latexrészecskékhez, aminek következtében a bevont latexrészecskék összetapadnak (agglutinálódnak). Az Aust. Vet. J. 56, (1980) irodalmi helyen található közlemény kísérletet ir le újszülött csikók kolosztrum-immunglobulinjai adszorpciójának a kimutatására. E vizsgálat során a latexrészecskéket és az antiszérumot tisztított ló-immunglobulinnal elegyítik, hogy így a latexrészecskéket ló-IgG antitestekkel felülrétegezzék (bevonják). Inkubálás után az így bevont latexrészecskék mellől a nem adszorbeált ló-IgG- t friss pufferoldattal kimossák, majd pufferoldattal rekonstituálják. Ezt követően az antitest-latex-keveréket csikó-plazmából vett vizsgálati mintához adják. Daraszerű, fehér agglutináció megjelenése azt jelenti, hogy az immunglobulinok jelenlétére végzett vizsgálat pozitív. Az Am. J. Med., 21, 888 (1956) helyen leírják a la-2 tex-flokkulációs vizsgálat alkalmazását reumás ízületi gyulladás szerológiai diagnózisának céljából. Ennek során egy reumás faktornak (RF) nevezett IgG-immunglobulint alkalmaznak. A latexrészecskéket először humán gamma-globulinnal vonják be, majd inkubálás után az így bevont latexrészecskék mellől a nem adszorbeált gamma-globulint friss pufferoldattal kimossák, és utána pufferoldattal rekonstitúciót végeznek. Ezután a gamma-globulin és latex keverékét egy reumás ízületi gyulladásos beteg szérummintájához adják: így az ízületi gyulladásos betegek 71 boánál agglutináció lép fel. Ha a vizsgálatot úgy módosítják, hogy a latexrészecskékből álló szuszpenziót és szérumot gamma-globulin nélkül keverik össze, akkor a reumás szérumoknak mindössze 11%-ában lép fel agglutináció. A 3 088 875 számú Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban latex-flokkulációs vizsgálatot írnak le egy „C-reaktív” fehéje felismerésére, amely főként aktív gyulladásban vagy szövetroncsoló kóros állapotban szenvedő betegek szérumában fordul elő. E vizsgálat során a latexrészecskéket humán gammaglobulinnal keverik, majd 57 °C hőmérsékletre melegítik. Ezután az antitesttel bevont latexrészecskéket egy beteg hígított szérumával elegyítik. Az agglutináció fellépése a C-reaktív fehérje jelenlétét igazolja. A 3 551 555 számú Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban olyan vizsgálatot közölnek, amely antigén — például humán choriongonadotropin — kimutatására alkalmazható. E vizsgálat során a latexrészecskéket először közömbös fehérjével — például albuminnal vagy laktalbuminnal — vonják be, majd vagy egy antigénnel vagy egy antitesttel e bevonatot felülrétegezik. A fehérje-antitest vagy fehérje-antigén bevonatú latexrészecskéket ezután egy beteg hígított szérumával elegyítik. Az agglutináció fellépése egy antigén jelenlétére utal. Az összes, fentiekben említett szabadalmi leírások és közlemények szerint a latexrészecskéket először egy fehérjetartalmú anyaggal vonják be, majd az így bevont latexrészecskéket egy második reagenssel kölcsönhatásba hozzák. így a második reagens a latexrészecskék között térhálósodást hoz létre, és „hídképző” agglutináció következik be. Egyetlen közlésben sem tesznek kinyilvánítást vagy javaslatot arra vonatkozóan, hogy csikók vagy borjak IgG szintje (koncentrációja) vagy egy kanca vagy tehén kolosztrumában levő IgG szintje (koncentrációja) antitest-antigén-reakció alkalmazása nélkül meghatározható. A találmány tárgya eljárás IgG mennyiségének meghatározására újszülött csikóban vagy borjúban vagy kanca vagy tehén kolosztrumában. Á találmány szerinti eljárás abban áll, hogy egy testfolyadékmintát biológiailag közömbös latexrészecskékkel érintkezésbe hozunk, s a fellépő agglutináció mértékét, és ennek alapján a mintában jelenlevő IgG mennyiségét meghatározzuk. A latexrészecskéket pufferoldat segítségével 7,5—9,0 pH-érték mellett körülbelül 0,65—2,0 súly/térfogat-% végkoncentrációra hígítjuk. A testfolyadékot körülbelül 7,5—9,0 ph-értéken, a pufferoldattal körülbelül 0,01:12-től 0,01:2160 térfogatrész/térfogatrész koncentrációtartományra hígítjuk. Az IgG kritikus szintje (koncentrációja) valószínűleg a következő: 200 mg/dl alatt terápia szükséges; 5 10 15 20 25 J'J 35 ‘10 ‘15 50 55 50 65 2
