186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 186 73-1 2 csak néhány típusának kialakítására. Az enzimeknek megfelelőknek kell lenniük az előzőekben - a kinetikai módszernél — leírt típusú acil-enzim intermedier előállítására, és főleg olyan tulajdonságokkal kel! rendelkezniük, amelyek lehetővé teszik az intermedier amino- 5 lízisét abban az esetben, amikor k.4 « k4 (lásd 1. reakcióvázlat), hogy ily módon az előállított pepiid gyors hidrolízise elkerülhető legyen. Az acil-enzim intermedierek képződéséhez az alkalmazott, szubsztrát komponensben levő C-terminális védöcsoport lehasííása szükséges, azaz 10 jelen esetben az észteráz vagy amidáz aktivitás érvcnycsiilése. Szintézis során az említett aktivitásnak meg kell haladnia az enzim peptidáz aktivitását az alkalmazott reakciófeltételek mellett. Ezeket a tulajdonságokat találtuk a karboxipeptidázok- 1 5 nak nevezett exopeptidáz csoportban, mely enzimek képesek a peptidek olyan hidrolízisére, mely során szabad karboxil-csoportok keletkeznek. Azt találtuk, hogy ezeknek az enzimeknek sokasága eltérő enzimaktivitást mutat, amely elsősorban a pH-tóI függ, így például 8 és 10,5 20 közötti pH-éríéken túlnyomórészt az észteráz és amidáz aktivitás kerül előtérbe, és pH 9 és 10,5 közötti érteken nincs vagy csak csekély mértékben van peptidáz aktivitásuk. Mindezek a tulajdonságok előnyösen használhatók fel a találmány szerinti eljárásban, mivel ezek révén jó 25 kitermelés biztosítható. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a szerin- vagy tiol-proteázok különösen megfelelőek az acil-enzim intermedierek előállítására. A karboxipeptidázok előnyös csoportja ezért a szerin- és tiol-karboxipeptidázok. Ezé- 30 két az enzimeket előállíthatjuk élesztőgombákkal vagy lehetnek állati, illetve mikrobiológiai eredetűek. Különösen jól alkalmazható az élesztőgombából (CPD-Y) nyerhető karboxipeptidáz-Y. Ezt az enzimet Hayashi (Kinetic studies of earboxypepiidase-Y; J, Bio- 35 chem. 77, 69-79, 1957) és Johansen (Isolation of enrboxypeptidase-Y by affinity chromatography; Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14, 1976) ismerteti, akik egy különösen jól alkalmazható tisztítási eljárást dolgoztak ki. A tisztítást affinitás kromatográfiai módszerrel végzik 40 oly módon, hogy a polimer-gyanta mátrixhoz benzil-szukcinil csoportot kapcsolnak. A CPD-Y - amely egy szerin enzim - pH > 9 értéknél a már korábban említett aktivitást mutatja és ugyanakkor endopeplidáz aktivitása nincs. Szabad atía-karboxil-csoportokka! rendelkező 45 C-terminális aminosavak vagy észterek vonatkozásában mutatott specifikussága miatt, a CPD-Y azokat a peptideket is hidrolizálhatja, amelyekben a C-terminális alfa-karboxíl-csoport egy észter- (aikil- vagy arii-cszter) formában, illetve amid, N-szubsztituált-umid (például 50 aniiid) formájában van jelen. Fontos még, hogy ezek az enzimek a legtöbb szubsztrátot hidrolizálni tudják, függetlenül a C-terminális aminosav-gyökök típusától. A CPD-Y további előnye, hogy nagy mennyiségekben gyártható cs viszonylag nagy stabilitású. A Cl’D-Y ugyan 55 a legmegfelelőbb enzim a találmány megvalósítására, de a találmány szerinti eljárás az alábbi felsorolásban szereplő enzimekkel is végezhető. 60 Enzim Eredete Pcnicillo-karboxipeptidáz S-2 Karboxipeplidáz(ok) K a rbox i pepi idáz(ok ) Karboxípep! i dáz( ok) Karboxipcptidáz C N Phazeol.iin Karboxipepiidáz(ok) Pénicillium janthinellum Aspergillus saitoi Aspergillus oryz.ae Növények: narancsfa levele: narancs-gyümölcshéj cittus natsudaidai Hayata zöldbablevelek csírázó árpa, csírázó gyapot, paradicsom, dinnye, ananász-bromelain A bovin típusú karhoxipeptidáz A és B (CPD-A és CPD-B) már nem megfelelőek, mivel azok metailokarboxipeptidázok. Mint korábban már részleteztük, a szintézis egyrészt az úgynevezett szubsztrátkomponens, amelyet savkomponensnek vagy donornak is neveznek (amely az A részt tartalmazza), másrészt az úgynevezett amin komponens, amelyet nuklcofil komponensnek vagy akceptomak neveznek (amely a B részt tartalmazza) reakcióján alapszik, ily módon kialakítva az A-B peptidet. Az A rész, amelv egy aminosav-gyök vagy egy peptidgyök. kívánt esetben védett N-terminális amino-vegyüiet is lehet, hogy a nemkívánt másodlagos reakciókat elkerüljük. Az aminc-csoport védelmének szükségessége a peptid-gyök szénláncának a növekedésével csökken és már nincs jelentősége, ha a peptid-gyök három aminosavból áll. természetesen annak a típusától és szekvenciájától függően. Előnyös aminosavak például az alifás aminosavak, mint a monoamino-monokarbonsavak, például giiein (Oly), alanin (Alá), valin (Val), norvalin (Nva),!eucin (Leu), izoleucin (íso-Leu) és norlcucín (Nie), továbbá hidrnxi-aminosavak, mint a szerin (Ser), treonin (Thr) és homoszerin (homo-Ser). kéntartalmú aminosavak, mint a metionin (Met) vagy císztin (CysS) és cisztcin (Cysh). moRoamino-dikarbonsavak, mint az aszparaginsav (Asn), glutaminsav (Giu), aszparagin (Asn), glutamin (Gin), diamino-monokarbonsavak, mint azomittn (Om), lisin (Lys) cs arginin (Arg), aromás aminosavak, mint a f'cnilalanin (Phe) és tirozin (Tyr). továbbá a heterociklikus aminosavak. mint a hisztidin (His) és triptofán (Trp). Védőcserportként használhatunk peptidkémiában ismert védőcsoportokat. így benzoil- (Bz), aceíil- (Ac) vagy tercier alkoxiknrbonil-csoportot, például t-buíiloxikarbonil-(BOC-), t-amiloxikarbonil-(t-AOC-), benz.iloxikarboníi-(Z-), p-metoxibcnzil-o.xikarbonii-(PMZ-), 3.5-dimeíoxi-benzi!oxikarbonil-[Z(OMe)2-], 2,4,6-trimetilbenztí-oxikarbonil-(TMZ-), p-fenilazobenzil-oxikarbonil-(PZ-), p-toluoiszulfonil-(Tos-), o-nitrofeni!szull'cnil csoport (Nps-) és hasonlóak. L.lönvös védöcsoporlnk lehetnek például a benzitoxikarhonü- cs t-butiloxikarhonil-csoportok, mivel ezek könnyen clőállíthaióak, felhasználásuk gazdaságos és könnyen lehasíthntóak. A lenti s/ubsztrát-komponens az alábbi vegyületek bármelyike lehet: Gombák : Penicíllo-karboxipeptidáz Pénicillium janthinellum S-l a ) aminosav-észter, peptid-észter vagy A-OR’ általános képletéi deps/ipeptid. ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal és R1 jelentése 1-4 szén- 65 atomos aikil- vagy fenil-(l-4 szénatomos alkil)-4
