186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
186 734 2 csoport vagy egy aminosavgyök alfa-dezamino fragmense, b) kívánt esetben egy A-NH2 képletű aminosav-amid vagy peptid-amid, ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal, vagy c) kívánt esetben A-X általános képletű N-terminális védeti peptid, ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal és X jelentése egy aminosav. Fentiekben ,,alkil”-csoport alatt egy egyenes vagy elágazó szénláncú alkil-csoportot értünk, amelynek szénatomszáma 1 és 6 között van, például lehet metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, terc.-butil-, amil-, hexil-csopcrt és más hasonló csoport. így az észterek esetében az OR1-csoport előnyösen aIkoxi-csoport, így metoxi-, etoxi- vagy t-butoxi- és benziloxi-csoport. Más csoportok is előnyösen használhatók, ha az aminosav-gyök vagy peptid-származék a karboxipeptidáznak megfelelő szubsztrát. Erre példa az úgynevezett depszipeptidek, amelyben a C-terminális aminosav-észter kötésen át kapcsolódik a peptidkötés helyett, például a benzoilglicin-fenillaktát (Bz-Gly-OPhe) esetében. Előnyösen használható karbonsav-védőcsoportok például az alkoxi-csoportok, különösen a metoxi-csoport vagy más szavakkal a szubsztrát komponens előnyösen egy amínosavmetilésztert tartalmaz, mivel ezeket könnyű előállítani és ugyanakkor jó szubsztrátok. Azonban például etil-észter, propil-észter, izopropil-észter, butil-észter, t-butil-észter, benzil-észter vagy terc.-butiloxi-észter ugyanolyan jól alkalmazható. Meg kell említeni, hogy az ionizálható csoportok, amelyek az egyes aminosavakban jelen lehetnek és amelyek az A peptid-gyök komponensei, kívánt esetben ismert módon védhetők, a csoport típusának megfelelően. Azonban ez nem mindig szükséges, amely éppen a jelen eljárás egyik előnyét jelenti. Ha a funkcionális csoportokat kívánjuk védeni, akkor az CO-amino-csoport (NfO) esetében megfelelő védőcsoportok lehetnek például az N<4>-benziIoxikarbonil-csoport (NÁCZ), t-butoxikarbonilcsoport (N^-BOC) vagy tozil-csoport (N^-Tos). Az argininben levő N-guanidino-csoport NG esetében megfelelő védőcsoport a nitro-csoport (N^-NOï), NG-benziI- oxikarbonil (NG-Z) és NG, NG-dibenzi!oxikarbonil-csoport (Ng-Z-Z). A hisztidinben levő imidazol-gyűrű (N'm) védőcsoportjaként N,m-benzil-csoportot (N,IT,-Bzl) és tozil-csoportot (Nim-Tos) alkalmazhatjuk. AzCü-karboxil-csoportokhoz megfelelő védőcsoportok például az <ü-benziloxi-csoportok (-OBzl). Az alifás vagy aromás hídroxi-aminosavak hidroxi-csoportjainak megfelelő védőcsoportok az aralkil-csoportok, mint például a benzil-csoport (Bzl). A CysH-ban levő merkapto-csoporlhoz megfelelő S-védőcsoport például a benzil-csoport (Bzl). A védőcsoportoknak a primer reakciók során stabilnak kell lenniük, és a végtermékről könnyen lehasíthatóknak, oly módon, hogy az szekunder reakciókat ne okozzon. A találmány szerinti eljárás elvileg bármely aminosavval, mint szubsztrát-komponenssel megvalósítható. A reakció másik komponense az úgynevezett aminkomponens, amely az alábbi csoportok bármelyike lehet: a) H-B-OH általános képletű L-aminosavak, amelyben B jelentése a már megadott, b) H-B-NR3R3 általános képletű, mely képletben B jelentése aminosav-gyök és R3 és R3' jelentése hidrogénatom, hidroxi- vagy ; mino-csoport — adott esetben N-szubsztituált aminosav-amidok, c) I l-B-OR4 általános képletű - mely képletben B jelentése aminosav-gyök és R4 jelentése l—4 szénatomos alkil-csoport — uminosav-csztcrck. Látható, hogy R3 = hidrogénatom szabad amidot, míg R3 = üli egy hidroxámsavat, R3 = amino-csoport hidiazidot jelöl. A találmány szerinti eljárás így például előnyösebb, mint a már idézett Isowa- és Morihara-eljárás, mivel mind szabad aminosavakkal (C-terminálisan nem védett), mind C-terminálisan védett aminosavakkal (például az aminosavak megfelelő amidokká, anilidekké, hidrazidokká. észterekké vagy más karboxil-származékokká történő alakításával) megvalósítható. A? amin-komponens vonatkozásában a reakció-szekvencia. kitermelés stb. nagymértékben függ attól, hogy szabad amínosavat vagy C-védett származékát, pl. amidját alkalmaztuk-e kiindulási komponensként. Mindezt a példák kapcsán részletesen bemutatjuk, mindenesetre azonban az alábbi általános kép bontakozik ki. Ha olyan szabad aminosavakat alkalmazunk, amelyek hidrofob aminosavak, mint az alanin, leucin, valin és feni! alanin. valamint pozitív töltésű oldalláncú aminosavak. mint a lizin vagy arginin, akkor a szubsztrátkomoonens láncához történő kapcsolás könnyen elvégezhető míg bizonyos aminosavak, amelyek oldallánca akár karboxil-csoportot (glutaminsav), akár hidroxil-csoportot (szerin cs treonin). akár amid-csoportot (aszparaginsav és glutaminsav) tartalmaz, reakciója már lényegesen nehezebben megy. A heterociklikus aminosavak - mint a prolin és hisztidin - szabad aminosavként történő alkalmazása rendkívül nehéz. Különbség van abban is, ha amin-komponensként C-terminálisan védett aminosavakat, például aminosav-amidokat vagv N-szubsztituált-amidokat, például hidrazidor vagy anilidct alkalmazunk. Ezt a későbbiekben még részletezzük, de általánosságban elmondható, hogy ebben az esetben a reakció nagymértékben független a szerkezettől és igen magas kitermelést (90 %-ig) eredménye/: azonban itt is a heterociklikus aminosavak nehezebben alkalmazhatók, mint az alifás aminosavak. Mint korábban leírtuk, a találmány szerinti eljárás pH 5,0 és I0.5, előnyösen 8,0 és f0.5 közötti értéken végezhető. Az előnyös pH-érték, amely gyakran igen szűk tartomány, a pH-optimumíól cs pH-minimumtól függ. tekintettel arra, hogy az alkalmazott enzimek különböző enzim-aktivitásúak, következésképpen a pH- ci tekét úgy kell megválasztani, hogy az enzimaktivitások a korábban említettek szerint optimális egyensúlyban legyenek. Általánosságban elmondható, hogy a peptidáz aktivitás pH 9 alatt a pH csökkenésével növekszik, mely az eljárás kitermelése vonatkozásában nem előnyös. Azonban néhány esetben. így Bz-Ala-Gly vagy Bz-AIa-Gly-NH2 esetében a keletkezett peptidek vagy peptid-aminok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
