186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 186 734 /. reukcióvázlai CT = kimotripszin. Először egy enzim-szubsztrát-komplcxet képzőnk, amelyet az Ac-Phe-CT acil-enzim intermedier képzése követ. Ez utóbbit vízzel hidrolizáljuk, amikor Ac-Phe-OH keletkezik, ha azonban a nukleofil R-NH2 is jelen van, akkor az acil-enzim intermedieren a hidrolízisen kívül aminolízis is bekövetkezik. Feltételezve, hogy k3 » k-3 és k4 » k-4, az aminolízis és hidrolízis aránya csak k4/k3-tól, valamint a nukleofil részek koncentrációjától függ, amely 55 mól vízzel egyenrangú. Fastrez és Fersht kimutatták, hogy például 1 mól alaninamid pH 10-nél 44-szer erősebben nukleofil, mint 55 mól víz, amely az N-acildipeptid-amid nagy részének (több mint 95 %) képződése során keletkezett. Morihara és Oka (Alpha-chymotrypsin as the catalyst for peptide synthesis; Biochem. J. 163, 531—542, 1977., Peptide bond synthesis catalyzed by alpha-chymotrypsin; J. Biochem. 84, 1277-1283, 1978., Trypsin as a catalyst for peptide synthesis; J. Biochem. 82, 1055- 1062, 1977., Protease as a catalyst for peptide synthesis, Symp. on Peptide Chemistry in Japan, Osaka, pp. 79—84, 1977.) ezt az elvet alkalmazták az enzimatikus peptidszintézishez. Kimotripszint és tripszint használva, a peptidek sokaságát szintetizálták N-acilaminosav észterekből és aminosavak nukleofil származékaiból és kimutatták, hogy a reakció tisztán kinetikai, mivel magas kitermelések érhetők el, függetlenül a termék oldékonyságától. Az előzőekben említett tanulmányok azt mutatják, hogy a kinetikai módszereknek számos előnye van a termodinamikai módszerekkel szemben: 1. Gyorsabb a reakció (bizonyos esetekben néhány perc alatt lejátszódik). 2. Lehetséges alacsony enzim-koncentrációkat alkalmazni. 3. Az aminosav oldalláncait nem szükséges védőcsoportokkal ellátni. 4. Immobilizált és nem oldható enzimek is használhatók, mivel a peptidek oldatban vannak, és ezzel az automatizálás feltétele is adott. Tekintettel arra, hogy a reakciótermékek oldhatóak is lehetnek, a szintézisnek gyorsabbnak kell lennie, mint a termék másodlagos hidrolízisének, hogy az elkülönítést időben elvégezhessük. Továbbá, az ismert kinetikai módszerek csak korlátozott mértékben alkalmazhatóak, mivel a vizsgált enzimek specifikus tulajdonságai a különböző peptidkötések szintéziséhez különböző enzimek használatát teszik szükségessé. Ráadásul, a nagyobb peptidmolekulák szintézise a hidrolizáiandó molekulán belül belső peptidkötések kialakulásához vezet az alkalmazott enzimek endopeptidáz aktivitása következtében, függetlenül az enzimek észterbontó aktivitásától. A találmány tárgya egy eljárás peptidek enzimatikus szintézisére, mellyel áthidalhatóak a technika állásának előzőekben említett hiánosságai és jellegéből adódóan nem korlátozódik specifikus aminosav komponensek használatára, továbbá elkerülhető a belső peptidkötések későbbi hidrolízise. Főleg az említett, de más előnyök is elérhetők az A-B ^ általános képlctű - mely képletben 20 B jelentése N-terminálisan védett L-aminosav-gyök vagy C-terminális L-aminosavval rendelkező, adott esetben N-terminálisan védett peptidgyök és jelentése adott esetben C-terminálisan védett L-aminosav-gvök -25 30 35 40 vegyülclck előállításával oly módon, hogy az alábbiak köztil egy a) A-OR1 általános képletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal, R1 jelentése 1-4 szénatomos alkil- vagy fenil-( 1 —4 szénatomos alkil)-csoport vagy egy aminosav alfa-dezamino fragmense - aminosav-észtert, peptid-észtert, depszipeptidet. b) ANH2 képletű - mely képletben A jelentése a már megadott - aminosav-amidot vagy peptid-amidot, c) A-X általános képletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal és X jelentése cgv aminosav adott esetben N-terminálisan védett peptidet, az alábbi vegyületek valamelyikével mint amin-komponensscl a) H-B-OH általános képletű L-aminosav, amelyben B jelentése a fentiekben megadott -b) adott esetben N-szuhsztituált, H-B-NR3R3 általános 45 képlctű - mely képletben B jelentése aminosavmnradek cs R3 és R3' jelentése hidrogénatom, hidroxi-, aminocsoport - L-aminosavamid, c) H-B-OR4 általános képletű - mely képletben B jelentése aminosav maradék és R4 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport - -aminosav-észter, I -specifikus szerin- vagy tiol-karboxipcptidáz enzim jelenlétében, 5 és 10,5 pH-jú vizes oldatban vagy diszperzióban, előnyösen 20 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten 55 rcagáltalunk cs kívánt esetben a keletkezett peptidről az R4 vagy N-termináiis védőcsoportot lehasítjuk. A találmány alapvető változást jelent a technika állásában. mivel exopeptidáz.okat alkalmazunk az eddig hasonló) célra használt enzimek helyett, amelyek túlnyomó- 50 részt vagy bizonyos mértékben endopeptidáz aktivitással rendelkeztek. Azt találtuk, hogy az exopeptidázoknak egy széles specifikus peptidáz aktivitást kell mutatniuk, miáltal a szélesebb specifikus hatás következtében a szintézis teíje- 65 set b és nem korlátozódik a peptidkötések egyszerűbb és 3
