186121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagyttisztaságú A-ristomycin és/vagy ristomycin-származék előállítására és ezt tartalmazó reagens thrombolyta aggregációs vizsgálatokhoz
186121 a) Mettler FP-5 (fotocellás regisztráló) olvadáspont készülékkel vizsgálva a termék 165—170 °C-on kezd bomlani. b) Nagynyomású folyadékkromatográfiás (Hewlett-Packard 1082, HPLC) készülékkel az anyagról kitűnő minőségű kromatogrammot kaptunk. c) Rétegkromatográfiás körülmények között egységes az anyag, vizes oldatban 280 nm-en mért loge értéke 4,0—4,5 közé esik és szulfáthamu tartalma pedig nem haladja meg a 0,25%-ot. Vízsugár pumpával (kb. 15 Hgmm-en), az aceton forráshőmérsékletén, 4 órán keresztül végzett folyamatos szívatás mellett az A-ristomycin-monoszulfát súlyvesztesége legfeljebb 1—2,5%. A nyerstemék, valamint az 1. és 2. példa szerint előállított A-ristomycin-monoszulfát vékonyréteg-kromatográfiás jellemzését a következő módon végezzük. I. Az A-ristomycin minta frissen készült 1—2%os vizes oldata II. 1. DC-Alurolle cellulóz (Merck. 0,1 mm) vékonyréteg 2. Fixion 50x8 lemez (REANAL) III. Oldószerelegyek a futtatáshoz a) n-butanol-piridin-ecetsav-víz (15:10:3:12) vagy b) n-butanol-pridin-n-propanol-ecetsav-víz (20:10:5:3:32) felső, szerves fázisa a II. 1. vékonyréteghez. A II. 2. vékonyréteg ekviíibrálásához és futtatásához pH=6-os cifrát-puffert alkalmaztunk ionmentes vízben : 7.0 g citromsavat 4.0 g nátrium-hidroxidot 81,9 g nátrium-kloridot és 100 ml metil-cellosolvot 1000 ml-es mérőlombikban oldottuk és deszt. vízzel jelig töltöttünk. IV. Előhívó: Pauly-féle reagens 0,05 g diazotált szulfanilsavat 10 ml 10%-os nátrium-karbonátban oldottuk és frissen készítve használtuk fel. A tiszta nyerstermék cellulóz rétegen az a) oldószerelegyben Rf = 0,59, a b)-ben Rf=0,52 értéknél jelentkezik. Fixion 50x8 lemezen pH = 6-os citrát-pufferben Rf = 0,61-et határoztunk meg. A reagens nagyon érzékeny, gyakorlatilag minden bomlásterméket jelez és a kimutatási alsó határ 0,5—1,0 pg. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatainkat Hewlett-Packard 1082 izokratikus üzemeltetésű HPLC készülékkel végeztük. Vizsgálatainkhoz gyári, Cg-Lichrosorb (10 //m-os) töltésű (4,6 x 20 mm-es méretű) analitikai oszlopot alkalmaztunk. Az A-ristomycin minták hatóanyagtatalmát 254 nm-en működő UV-detektorral indikáltuk. A mintákból 1 mól-os oldatokat készítettünk és 20—30 p 1 aliquot részleteket fecskendeztünk az oszlopba. A kromatogrammok készítéséhez legalkalmasabb eluens (I. és II.) összetételt, folyadék-áramot és regisztrálópapír sebességet az alábbiakban adjuk meg: I. eluens: 12% metil-cellosolvot tartalmazó Sörensen szerint készített pH = 6,3-as citrát-puffer. Folyadékáram: 2,0 ml/perc. Regisztrálópapír sebesség: 0,1 cm/perc. II. eluens: 10% acetonitrilt tartalmazó pH = 7,30- as ammónium-formiát-oldat (hangyasavmentes) Folyadékáram: 30 ml/perc Regisztrálópapír sebesség: 0,3 cm/perc Az 1. és 2. péda szerint előállított, kristályos A-ristomycin-monoszulfát stabilitását, a szilárd minták UV-fénysugárzását, különböző koncentrációjú vizes oldatainak hősterilezését követően, illetve +4°C-on TRIS-pufferben való állás mellett tanulmányoztuk. a) 50—100 mg A-ristomycint dugóval lezárt üvegben, 40 órán át ultraibolya fénnyel sugároztuk be, úgy hogy a mintát tartalmazó edényt kb. 20 cm távolságra helyez:ük a lámpától. 40 óra besugárzás után készített oldat színe kissé mélyült és 15 mg/ml-es koncentrációban a humán thrombocytákat már csak lassan aggregál ta b) A-ristomyeinbőí desztillált vízben két hasonló hígítású (0,39 mg/ml illetve, 0,35 mg/ml) és egy töményebb (6,8 mg/ml) oldatot készítettünk, melyet 3 órán át 100 °C-os vízfürdőben tartottunk. Időnként az elpárolgó víz pótlása után mintát vettünk és szobahőmérsékletre való hűtést követően a 280 nm-en mért fényelnyelés intenzitásából meghatároztuk az Éjem értékeket. Megállapítható, hogy a 100 °C-on tartott oldatok fényelnyelése nem lineárisan növekszik. 0—1 óra közötti tartományban a liofilizálással visszanyert szubsztanciák vékonyréteg- és nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat alapján még nem jeleztek bomlást. Az anyagok a normális humán thrombocytákat a kívánt koncentrációban megfelelően aggregálták. c) A ristomycinből TRIS-pufferben (pH = 7,4) 15 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk és + 4 °C- on jégszekrényben 12 héten át tároltuk. A törzsoldatból kéthetenként elvégeztük a szokásos thrombocytaaggregációs kísérletet, illetve megfelelő pufferes hígítást (0,2 ml-" 10 rcl-re) és meghatároztuk az Eu* értékét. A vizsgálat időtartalma alatt az A-ristomycin oldat aggregációs aktivitását és E'di értékét változatlanul megtartotta. 3. példa Bisz-N,N'-trifluor-acetU-A-ristomycin előállítása 206 mg A-ristomycint 10 ml absz. metanolban elszuszpendáltunk és jeges hűtés közben 0,28 ml trifluor-ecetsavanhidridet csepegtettünk hozzá. Ezután az elegyet szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd vákuumban szárazra párokuk. A párlási maradékot absz. metanolban újra oldottuk és ismét bepároltuk. Ezt a műveletet ezután még háromszor megismételtük, majd a témákét vákuumexikátorban izzított kalcium-kiorid és paraffin-forgács felett súlyállandóságig szárítottuk. Hozam: 90%. A bisz—N,N'-trifluoracetil-A-ristomycin nem rendelkezett jellegzetes olvadás (bomlás)-ponttal. Standardizalás: cellulóz rétegen a III. a) oldószerelegyben (lásd 2 példa) kromatografáiva Rf=0,45 értéket mutat. Analízis CwHicsChsNgFs (2258)-ra számított F% = 5,05; N% = 4,96; talált: F% = 4,91 ; N% = 4,86; 4,88 4,74 5 10 IS 20 25 30 35 •10 45 50 55 60 65 5
