186014. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarhák parainfluenza-3 virus okozta megbetegedése elleni inaktivált, adjuvált oltóanyag előállítására
\ 186014 A 2. táblázat mutatja, hogy az etiléniminnel inaktivált vírus az élővírus antigén hatását eléri mind a vírussemlegesítési, mind a hemagglutinációgátlási próbában. A találmány tárgya tehát eljárás a szarvasmarhák parainfluenza-3 vírus okozta megbetegedése elleni inaktivált, adjuvált vakcina előállítására. A találmány szerint úgy járunk el, hogy az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00212, illetve 00213 szám alatt letétbe helyezett R/GY 4/5 jelű és R/ME 9/7 jelű parainfluenza-3 vírustörzseket külön-külön kolosztrummentes borjak veséjéből készített sejttenyészeten szaporítjuk, a 107 TCID5o/0,1 ml infektív titer elérése után a kü- Iön-külön elszaporított két vírustörzset összekeverjük és előnyösen etiléniminnel — inaktiváljuk, a kapott folyadékot adott esetben az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00214 szám alatt letétbe helyezett BF/9 jelű RS-vírus hasonlóképpen készített és inaktivált tenyészetének vírustartalmú folyadékával és adott esetben más protektiv anyaggal összekeverjük, majd önmagában ismert módon adjuváljuk és kiszereljük. A fenti két PI-3 vírustörzset kolosztrummentes borjak veséjéből készített sejttenyészeten szaporítjuk, amikoris tápfolyadékként Hanks oldatot használunk, amelyhez 15% (kolosztrummentes borjak véréből származó) savót adunk. Fenntartó folyadékként Earle oldatot használunk. Az egyrétegű sejttenyészetet a tápfolyadék lecserélésével egyidejűleg fertőzzük, a vírus másfél órás adszorbeáltatásával. A vírustartalmú fenntartó folyadéknak legalább 107 TCID5Ü/0,1 ml infektív titerűnek kell lennie. A külön-külön elszaporított két vírustörzset egyenlő arányban keverjük. Az így készített oltóanyagot inaktiváljuk, előnyösen etiléniminnel. Kívánt esetben tartósítószert adagolhatunk, előnyösen nátriumazidot. Bizonyos esetekben az inaktivált oltóanyaghoz más komponenseket, előnyösen hasonló módon tenyésztett és inaktivált RS-vírust, vagy egyéb protektiv anyagként koncentrált, feltárt Pasteurella-antigént is adhatunk. Az adjuváláshoz bármely ismert adjuvánst használhatunk, a Human Oltóanyagtermelő Intézet inkomplett olajos adjuvánsát azonban előnyben részesítjük. A kész vakcinát steril körülmények között szereljük ki. A találmányt az alábbi példákkal részletesebben ismertetjük. 1. példa Monovalens PI-3 vakcina előállítása Az R/GY 4/5 és az R/ME 9/7 jelű PI-3 vírustörzseket borjúveséből készült egyrétegű sejttenyészeteken külön-külön elszaporítjuk. Tápfolyadékként 15% kolosztrummentes borjúból származó vérsavót tartalmazó Hanks oldatot, fenntartó folyadékként pedig Earle oldatot használunk. (A Hanks és az Earle oldat összetételét lásd a Bakács—Farkas: Orvosi virológia, Medicina kiadó Budapest, 1965. 129—130. oldalán.) A vírusokat 2000 ml-es Roux-palackokban szaporítjuk. Miután az egyrétegű sejttenyészet kialakult, a tápfolyadékot leöntjük és a vírusokat a sejtréteghez adszorbeáltatjuk. A másfél órás adszorpciót követően a tenyészetekre Earle oldatot öntünk. A tenyészeteket 37 °C-on inkubáljuk a 80% sejtkárosító hatás (CPE) megjelenéséig. A vírustartalmú fenntartó folyadéknak ekkor legalább 107 TCIDso/0,1 ml infektív titerűnek kell lennie. A külön-külön elszaporított vírusokat ezután azonos mennyiségben összekeverjük. Az elegyített vírust 37 °C-on 24 órán át kezeljük 250//g/ml koncentrációjú etiléniminnel. Kezelés után a folyadék pH értékét 7,2—7,4 közötti értékre állítjuk be. Az inaktivitás eredményességét az előbb leírt sejttenyészetekre való oltással ellenőrizzük. A vakcinát utána oly módon adjuváljuk, hogy az inaktivált vírusfolyadékhoz azonos mennyiségű „Human” inkomplett olajos adjuvánst, majd tartósítószerként 0,03% nátriumazidot adunk. Szobahőmérsékleten addig homogenizáljuk az anyagot, míg az olajos és a vizes vírusfázis már nem különül el egymástól. Az inaktivált és adjuvált vakcinát sterilen üvegekbe töltjük és légmentesen lezárjuk. 2. példa PI-3 és RS vírust tartalmazó kombinált vakcina előállítása Az 1. példában ismertetett módon inaktivált PI-3 vírustartalmú folyadékhoz az alábbiak szerint készített inaktivált RS vírusfolyadékot adjuk. A borjúveséből a fent leírt módon készítünk elsődleges sejttenyészetet. A tenyészet kialakulása után 0,025% tripszinoldattal emésztésnek vetjük alá. A sejteket 15% (kolosztrummentes borjúból származó) vérsavót tartalmazó Hanks oldatban reszuszpendáljuk, és a szuszpenziót a BF/9 jelű RS vírustörzzsel beoltjuk. Az oltó vírusnak legalább 104 TCID5o/0,l ml infektív titerűnek kell lennie. A sejtszuszpenzióhoz literenként 50 ml vírustartalmú folyadékot adunk. A vírussal fertőzött sejtszuszpenziót 2000 ml-es Roux palackokba dozírozzuk. Az ily módon előkészített másodlagos sejttenyészeteket 37 °C-on inkubáljuk. A mono-Iayer-nek legfeljebb 48 óra alatt kell kialakulnia. Ekkor a tápfolyadékot Earle oldatra cseréljük. A tenyészeteket 80%-os CPE megjelenéséig 37 °C-on inkubáljuk. A vírustartalmú folyadékot 250 /rg/ml etiléniminnel 37 °C-on 24 órán át inaktiváljuk. Tartósítószerként 0,03% nátriumazidot alkalmazunk. A BF/9 jelzésű RS vírustörzsből ily módon elkészített inaktivált anyagot 50% arányban elegyítjük az első példában leírt módon elkészített, inaktivált PI-3 anyaggal. Elkeverés után az elegyet azonos mennyiségben az első példában leírt módon inkomplett Freund adjuvánssal keverjük, majd sterilen dozírozzuk. A fentiek szerint előállított oltóanyaggal kísérleteket végeztünk az ártalmatlanságra és a hatékonyság megállapítása végett. Az ártalmatlanságot úgy vizsgáljuk, hogy nyulakat (testsúly kilogramban átszámítva) a borjakon alkalmazandó dózis (5 ml) ötszörösével oltottuk. Az állatokat 3 hónapig tartottuk megfigyelés alatt. Borjakat az alkalmazandó adag négyszeresével oltottuk és 3 hónapig megfigyelés alatt tartottuk. Ártalmatlansági vizsgálatokat az Oltóanyagellenőrző Intézet is végzett. A kísérleti vakcina használatát engedélyezte. A hatékonyságot az alábbiak szerint vizsgáltuk: 20 nyulat oltottunk egy alkalommal intramuscularisan 2 ml vakcinával. Az állatokat a 7., 10., 14., 21., 28., 35. 4
