186009. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfolipid-preparátum előállítására az aktivált parciális tromboplasztin idő meghatározására szolgáló új eljáráshoz
1 186009 2 állított ún. acetonpor kloroformos extrakciójával történik. Tulajdonképpen ezen az eljáráson alapszik valamennyi kommerciálisán kapható APTI reagens előállítása. A Bell-Alton eljárással szemben azonban már teoretikus alapon is több ellenvetés tehető, melyek kő- 5 zül a legfontosabbak: 1. Az egyszerű kloroformos extrakció a fehérjéhez szorosan kötött fcizfolipideket (foszfolipoproteineket) gyakorlatilag intaktan hagyja és a fehérjéhez nem kötött foszfolipideknek is csak egy részét extrahálja. 10 Az extraktum minősége ezáltal esetleges, változó, nagyban függ az extrakciót megelőző, megfelelően nem standardizálható lépésektől. 2. A kloroform a foszfolipidek mellett nagy mennyiségben egyéb kloroform oldékony anyagokat 15 is extrahál, melyek mennyisége, összetétele gyakorlatilag szintén nem standardizálható, s ezek az alvadás egyes fázisaival interferálhatnak. A fenti két elvi problémának gyakorlati szempontból is jelentős hátrányos következményei vannak: 20 A Bell-Alton technikát vagy annak minimálisan módosított változatait alkalmazó kommerciális reagensek aktivitása elég tág határok között változik. Különösen feltűnő ez a különböző gyártási számú reagenseket összehasonlítva, de sokszor ugyanazon cég 25 azonos gyártási számú kiszerelési termékén belül is lényeges eltérések észlelhetők, pl. saját eredményeink szerint a Gödecke-General Diagnostics cég Piatelin Plus Activatora, mely az egyik legjobb kereskedelmi APTI reagens, két különböző gyártási számú kiszere- 30 lése között lényeges, 4-5 sec-nyi aktivitáskülönbség észlelhető. Ennél súlyosabb hiányosság az, hogy egy gyártási számot viselő reagensek között esetenként igen lényeges eltéréseket találunk. Az I. Táblázatban szereplő adatok laboratóriumunk rutin véralvadásdi- 35 agnosztikai munkája során három reagenssel egy-egy esetben szerzett ilyen irányú tapasztalatokat mutatják. /. Táblázat 40 Egyazon gyártási számú reagensek esetenként megfigyelhető aktivitás változásai Reagens neve Gyártó cég PTT reagens (Immuno) PTT reagens (Hyland) Platelin Plus Act. Heti kontroll átlagok54 APTI (sec) 1. 2. 3. 4. 5. 6. hét 36,6 41,6 41,0 44,6 45,6 41,4 37,8 38,8 44,4 47,0 42,4 45,7 41,0 40,0 36,6 36,0 38,4 40,6 45 50 (Gödecke) 54 A heti kontroll átlagok összesen 35 normál kontroll plazmáján meghatározott APTI-k átlagértékét jelen- 55 tik. A reagens kevéssé standardizálható voltának további következménye, hogy érzékenysége — faktorhiányra, gátlótestre, de különösen heparinra — is igen változékony, amely a korábban említett indikációs terű- go letek némelyikén vagy mindegyikén adott esetben problémákat, nehézségeket okozhat. A fenti hiányosságok kiküszöbölését tűztük célul magunk elé és sikerült olyan új extrakciós eljárást kidolgoznunk, melynek segítségével olyan reagenst 65 nyertünk, mely jól reprodukálható eredményeket biztosít a meghatározáshoz és ezen felül még a preparátumok érzékenysége is tág határok között változtatható és optimálisra beállítható. A jelen találmány tárgya nagyérzékenységű, stabil foszfolípid előállítása, melyből készített reagens az APTI teszt három legfontosabb indikációs területén az eddig használt reagenseknél megbízhatóbb, reprodukál itóbb vizsgálati eredményt ad. Külön előnye találmányunknak az, hogy az eljárásunkkal előállított standardizált preparátumok heparin érzékenységét tág határok között változtathatóvá tesszük és így az érzékenységet optimálisra be tudjuk állítani. (1. ábra) A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy nyúlagyból acetonpor! készítünk a szokásos módon, melyet sósavas kloroform-metanol eleggyel extrahálunk. Ennek az extrakciónak az az eredménye, hogy az alvadás szempontjából oly fontos foszfolipoproteinek foszfolipid része is az extraktumba kerül. A nem lipid szennyeződéseket Sephadex G—25 oszlopon íávolítjuk el a preparátumból. A lipidet ultrahangos kezeléssel (szonikálás) szuszpendál uk, majd liofilizáljuk és így stabil, jól tárolható, könnyén szuszpendálható preparátumot nyerünk. Az extrakciós eljárás minden változtatás nélkül egyaránt alkalmazható agyból (nyúl, marha, emberi), illetve trombocita (marha, sertés, humán) preparátumból előállított acetonporra. A je'en találmány szerinti nagyérzékenységű, stabil foszfolipiddel előállított APTI reagens kiemelkedően jobb tulajdonságokkal bír, mint a többi APTI készítmény, tekintettel arra, hogy a három legfontosabb indikációs területen az eddig használt reagenseknél megbízhatóbb, jobban reprodukálható eredményt ad. Ennek az állításunknak az igazolására mutatjuk be a mellék -lt ábrákkal is illusztrált kísérleti eredményeket. (2 , 3., 4., 5. ábrák) Négy különböző preparátumunkat 25 normál plazma keveréken vizsgálva 3 sec. volt a két szélső érték között a különbség és egy adott sarzson belül az egyes mintái aktivitása is legfeljebb 2—2,5 sec eltérést mutatott. (A jelenleg alkalmazott kommerciális reagensekkel az eltérés mértéke a 4-5 sec-ot is eléri.) A Vili és IX faktor iránti érzékenységet normál és faktoríiányos plazmák különböző arányú, azaz különböző VIII illetve IX faktor szintű keverékén végzett egyfázisú faktormeghatározással teszteltük. Ennek a ’■ izsgálatnak az eredményét a 2. és 3. ábrán mutatjuk be. Az egyenesek meredeksége jelzi az érzékenységet, s az eredmények igazolják, hogy készítményünk és a kereskedelemben kapható legjobb reagensek között e tekintetben nincs lényeges különbség. A gátlótest iránti érzékenységet az jelzi, hogy a kontrc 11 és a beteg + kontroll plazma 1:1 arányú keveréke között milyen nagy alvadási időbeni eltéréseket mérünk (4. ábra). A vizsgált reagensek között csak a Behrirg cég Pathromtin-ja mutatott tesztünkhöz hasonló érzékenységet. Készítményünk heparinérzékenysége optimális. Ennek illusztrálására csatoljuk 5. ábránkat, mely megmutat, a, hogy a találmány szerint előállított készítmény a Boehringer cég termékével legalább egyenértékű és lényegesen jobb, mint a sok esetben alkalmazott Actin, a Dade cég gyártmánya. 3
