186009. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfolipid-preparátum előállítására az aktivált parciális tromboplasztin idő meghatározására szolgáló új eljáráshoz
186009 A vénás trombózisok megelőzésénél, illetve a már fellépett trombózis progrediálásának megakadályozásában alapvető jelentőséggel bír az intravénás, intramusculáris és subcután alkalmazott anticoaguláns heparin terápia. A heparin terápiát — tekintettel arra, hogy az adott dózisú heparin betegenként eltérő anticoaguláns hatást fejt ki — folyamatosan kontrollálni kell. Általánosan elfogadott, hogy erre legalkalmasabb teszt az APTI, ha az alkalmazott reagens megfelelő heparinérzékenységgel rendelkezik. Az APTI teszt heparinérzékenysége azt mutatja meg, hogy terápiás dózishatárok között a heparin mennyire nyújtja meg az aktivált parciális thromboplasztin időt. Ha a heparin hatása csak csekély APTI megnyúlást eredményez a reagens érzéketlen heparinra, alkalmatlan a heparin terápia követésére, illetve amennyiben erre használják, túldozírozást eredményezhet. Ezzel szemben, ha a reagens túlságosan érzékeny heparinra, terápiás dózisok hatására is kívül eshet az APTI a jól érzékelhető méréstartományon, s amennyiben a kezelést végző orvos ezzel nincs tisztában, aluldozírozás miatt nem kielégítő anticoagulációt végez. Ezért fontos, hogy a reagens optimális heparinérzékenységgel bírjon, azaz a terápis koncentráció (0,2—0,5 E/ml heparin) a normál érték 1,5—3,5-szörösére nyújta meg az APTI-t. Kísérleteink eredményei arra a felismerésre vezettek (1. ábra), hogy a foszfolipid hígítás változtatás az előbb megállapított optimális tartományon belül jelentős mértékben befolyásolja a heparin (az ábrán 0,5 E/ml) érzékenységet. Ennek alapján a foszfolipid preparátumok optimális hígítása heparinérzékenység szempontjából meghatározható, s ezt a hígítást használva reagensünk heparinérzékenysége mindig optimálissá tehető. Ezt úgy végezzük el, hogy a szonikált foszfolipid törzsoldatból imidazol vagy Owren pufferrel hígításokat végzünk és a hígításokhoz egyenlő térfogatú kaolin-szuszpenziót adunk. Az így kapott reagensekkel normál kontroll és heparinos plazmán APTI értékeket adó hígítások közül meghatározzuk azt, ahol a heparin az optimális heparinérzékenységnek megfelelő megnyúlást okozza és ez lesz a reagensben alkalmazott hígítás. így lehetővé válik reagensünk esetében, hogy a terápiás heparin koncentráció mindig a heparin kezelés követése szempontjából legmegfelelőbb (a normál érték 1,5—3,5-szöröse) APTI megnyúlást hozza létre. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példával szemléltetjük. Példa Emlős agyból vagy trombocitából az ismert módon előállított acetonpor 1 g-ját 20 ml acetonnal 20 percig mágneses keverővei keverjük, majd 2 óráig állni hagyjuk, szűrjük és szárítjuk. Ezután a koleszterin mentesítés után extraháljuk a lipideket: az acetonport 10 ml desztillált vízben homogenizáljuk, majd 11 rész kloroform .‘metanol oldószer 2:1 arányú keverékével, amely — a foszfolipid-tartalom teljes kinyerésére — 0,3%-os HCl-ot is tartalmaz, 2 óra hosszáig extraháljuk. A vizes fázis leválasztása után az extraktumot kb. 1/3 térfogat NaHCCb, Na2SC>4 1:4 keverékkel (szilárd) 15 percig keverjük és 15 perc állás után üvegszűrőn szűrjük. A szürletet 37 °C-on rotációs vákuumbepárlóban bepároljuk, majd a nyers lipidet Sephadex G—25 oszlopon megtisztítjuk. 3 g Sephadex G—25 coarse (Pharmacia) gélt egy éjszakán át duzzasztunk kloroform-metanol-víz 3:48:47 oldószerkeverékben. Ez az oldószerkeverék kloroform-metanol-víz 8:4:3 elegy felső fázisa (továbbiakban felső oldószer fázis). Az alsó fázis összetétele kloroform-metanol 2:1 (továbbiakban alsó oldószer fázis). A megduzzasztott gélt 1 x30 cm-es üveg csiszolattal ellátott oszlopra öntjük, majd az ülepedés után 4 ágytérfogat felső oldószer fázissal mossuk. Közvetlenül a lipid felvitele előtt az oszlopot 2 ágytérfogat alsó oldószer fázissal átmossuk (kb. 30 víz cm nyomás' sál). A lipidet szárazra párolás után az alsó oldószer fázisban felvesszük, (1 g acetonporra számítva kb. 10 ml), G—4-es szűrőn szűrjük az oldhatatlan szennyeződések eltávolítására, és a szürletet az oszlopra visszük kb. 3 g Sephadex-ből készített oszlopra maxi” mum 1 g acetonporból készült lipid vihető. A lipidoldat után még 2 ágytérfogat alsó oldószeres fázist engedünk keresztül az oszlopon, és az egész eluátumot bepároljuk. A szárazra párolt lipidet barna üvegbe átmossuk, kb. 3 ml kloroform-metanol 2:1 oldószerkeverékkel, és nitrogéngázzal bepároljuk, majd súlyállandóságig beszáritjuk (egy éjszakára vékuumexicátorban foszforpentoxid fölött hagyjuk). Ezt követően a kapott lipidet 20 mg/ml koncentrációban steril fiziológiás NaCl-oldatban potter típusú homogenizátorral homogenizáljuk, majd szonikáljuk (MSE ultrahang készülékkel 1,7 A, 2 X 30 sec, közben 30 sec hűtés olvadó jéggel), hogy egyenletes foszfolipid micellumokat tartalmazó oldatot nyerjünk. Az optimális foszfolipid koncentráció megállapítására a szonikált foszfolipid törzsoldatból imidazol vagy Owren pufferrel 5 x -ös, 10 x -es, 15 X -ös, 20 x - os, 25 x -ös, 50x-es, 100 x -os, 175 x-ös, 250 x-es hígításokat készítünk, s mindegyik hígításhoz egyenlő térfogatú 1%-os kaolin-szuszpenziót (0,04%-os Naazidban) adunk. (így a kaolin végkoncentrációja 0,5%-os, a végtérfogatban a foszfolipid hígítás lOxes, 20x-os, 3ÛX-OS, 40x-es, 50x-es, 100x-os, 200 x-os, 350 X-es, 500x-os lesz.) Az így nyert reagensek segítségével normál kontroll plazmán APTI I meghatározásokat végzünk. Az 1. ábra egy ilyen meghatározást mutat. A legrövidebb APTI értéket adó foszfolipid hígításokat használhatjuk (az 1. ábrán a 35 sec alá eső besatírozott területnek megfelelő hígítások képezik az optimális hígítási tartományt). Ezekután ezen belül meghatározzuk az optimális heparinérzékenységnek megfelelő hígítást. A legrövidebb APTI-t adó foszfolipid hígításokkal az előbb használt plazmán újra elvégezzük az APTI meghatározásokat, de ez esetben a plazmához 0,3 vagy 0,5 E/ml heparint (az ábrán 0,5 E/ml heparin) adunk. Az adott hígítások közül azt használjuk, amely legjobban megfelel az optimális heparinérzékenységnek, azaz amelynél az adott heparin a heparin nélküli plazmához viszonyítva 1,5—3.5-szörös APTI megnyúlást eredményez. 4
