186007. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormon antagonista peptidek előállítására
1 2 186 007 előállított struktúrának, egészszámú értékeket kapva a láncban levő minden amlnosavra. Fotoelektromos polariméterrel az optikai forgatóképesség: [alj? = 16,1° (c = 1,50% ecetsav). A pepiidet in vitro és in vivo vizsgáljuk. Az in vitro pióbához disszociált patkány-hipofízissejteket használunk, melyeket a próba előtt 4 napig sejttenyészetben tartunk fenn. A peptidek alkalmazására válaszképpen kialakult LH-szinteket a patkány-LH-ra specifikus radioimmunpróbával határozzuk meg. A sejttenyészeteket tartalmazó kontroll csészékhez csak 3 nanomol GnRH-t adunk, míg a kísérleti csészékhez 3 nanomol GnRH-t plusz 0,01-3 nanomol vizsgálandó peptidet. A csak GnRH-val kezelt mintákban szekretált LH mennyiségét összehasonlítjuk a pepiiddel pluszGnRH-val kezelt mintákban szekretált LH-mennyiséggel. Akiszámított eredmények alapján meghatározzuk a vizsgált pepiid és a GnRH mólkoncentrációjának azon arányát (aníagonista per GnRH), amely 3 nanomol GnRH által felszabadított LH mennyiségét a kontroll érték 50%ára csökkenti (ICRS0): ezt az értéket 0,005-nek találtuk. In vivo próbában meghatározzuk a fenti peptidek nőstény patkányok ovulációjára gyakorolt gátló hatását. F próbában meghatározott számú, 225- 250 g súlyú érett nőstény Sprague-Dawley patkányt beoltunk kukoricaolajban felvett 5 )Jg pepiiddel, déltájban a proösztrusz napján. A proösztrusz az ösztrusz (ovuláció) előtti dáutánra esik. Kontrollként külön nőstény patkánycsoportot használunk, melynek nem adunk be peptidet. A kontroll nőstény patkányok mindegyikénél ovuláció következik be az Ösztrusz idején, a kezelt patkányok egyikénél sem jön létre ovuláció. A peptid tehát nagyon hatásosan gátolja a nőstény patkányok ovulációját igen alacsony dózisokban, és a peptidet tökéletesen hatásosnak tartjuk 1 mg-os dózisban. A 2. számú peptidet hasonlóan szintetizáljuk és tisztítjuk. Az aminosavelemzés megtörténte után az optikai forgatóképességet fotoelektromos polariméterben meghatározva [or]f)2 = —69,3° ± 1 (c = 1,50% ecetsav). Az in vitro próbát hasonló módon végrehajtva azt találjuk, hogy a peptid ICRS0 értéke 0,011. In vivo 5pg dózist alkalmazva 10 patkány közül zérus, 2,5 pg dózisban pedig 2 állatnál következik be ovuláció. A 6. számú peptidet hasonlóan szintetizáljuk és tisztítjuk. Az aminosavanalízis után hasonló módon végzett in vitro próba szerint a peptid ICR5o értéke 0,008. ln vivo próbában 2,5 /ug dózis esetén 10 patkány közül zérus számú ovulál. A 8. számú peptidet hasonlóan vizsgáljuk in vivo 5 /Jg dózisban és 10 patkány közűi csak 2 ovulál. A 2. számú peptidet vizsgálva 5 /Jg dózis alkalmazásakor 10 patkány közül zérus és 2,5 pg dózis esetén 10 patkány közül csak 3 ovulál. A többi peptidet hasonlóan tesztelve azt találjuk, hogy szintén hatásosan gátolják nőstény patkányok ovulációját iger. alacsony dózisban. A találmány szerinti peptideket gyakran alkalmazzuk gyógys7erészetileg elfogadható savaddiciós sók, vagy fémkomplexek, például cinkkel, báriummal, kalciummal, magnéziummal, alumíniummal és hasonlókkal képezett sók (melyeket ennél az alkalmazásnál addiciós sóknak tekintünk), vagy a kettő kom- 5 binációjának formájában. Jellemző savaddiciós só a hidroklorid, hidrogén-bromid, szulfát, foszfát, nitrát, oxalát, fumarát, glükonát, tannát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, alginát, pamoát, malát, aszkorbát, tartarát és hasonlók. Ha a hatóanyagot tabletta formájában kell alkalmazni,a tabletta gyógy- 10 szerészetileg elfogadható hígítót tartalmazhat, kötőanyaggal, mint tragankanttal, kukorícakeményítővel vagy zselatinnal, szétesést elősegítő szerrel, mint alginsawal, és sikosító anyaggal, mint magnézium-sztearáttal együtt. Ha folyékony formát kívánatos alkalmazni, a gyógyszerészetileg elfogadható hígító ° részeként édesítő és/vagy ízesítő anyagot lehet használni. Intravénás adagoláshoz izotóniás sóoldatot, foszfát puffer oldatokat és hasonlókat alkamazhatunk. A találmány szerinti peptideket orvos irányítása 20 mellett kell alkalmazni. A gyógyászati készítmények a peptidet általában szokványos, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt Tartalmazzák. A dózis szokásosan mintegy 0,1-100 °g peptid per testsúly kilogramm. E peptidekkel a kezelés általában ugyanúgy történik, mint egyéb GnRH-antagonistákkal a 25 klinikai kezelés. E peptidek emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, orálisan, intranazálisan vagy intravaginálisan alkalmazhatók megtermékenyülés-gátlás és/vagy-szabályozás céljából. A hatásos dózisok az alkalmazás módjától és a kezelt emlős fajtájától függnek. Egy jellemző dózisforma fiziológiás konyhasóoldatban oldott peptidből áll, melyet körülbelül 0,1 - 5 mg per testsúly kilogramm tartományban alkalmazunk. Orálisan a peptid szilárd vagy folyékony formában adható. gr Bár a találmányt előnyös megvalósításának figyelembevételével írtuk le, mégis a szakember előtt nyilvánvaló módon változtatások és módosítások hajthatók végre a találmány szellemétől való eltérés nélkül. Így például a peptidkémiában ismert egyéb szubsztitúciók, amelyek nem csökkentik jelentősen a pep- 4C tidek hatékonyságát, szintén alkalmazhatók a találmány szerinti peptidekben. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 45 1. Eljárás X-R] -R2-R3-Ser -Tyr-R4-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (I) általános képletű dekapeptidek és savaddiciós sóik előállítására, ahol X hidrogénatomot, 1 4 szénatomos alkanoil- vagy 2-5 c/-. szénatomos alkenoilcsoportot jelent, 0 Rj jelentése dehidro-Pro R2 jelentése F-D-Phe és R3 és R4 jelentése D-Trp, vagy B-D-NAL, azzal a kikötéssel, hogy vagy R3 vagy R4 B-D-NAL-t jelent, 55 azzal jellemezve, hogy X' -R, -R 2 -R3 -Se r(X2 )-Tyr(X3 )-R4 -Le u-Arg(X4 )-Pro-Gly-NII2 (II) általános képletű dekapeptidről, ahol X1, X2, Xs és X4 a peptidkémiában önmagában ismert védőcsoport, és 60 R(, R2, Rj és R4 a fenti, 5
