186007. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormon antagonista peptidek előállítására
1 2 186 007 Példa A fentebb említett szilárd fázisú technikával az alábbi általános képletű peptideket állítjuk elő: X-dehidro-Pro-R2-R3-Ser-Tyr-R4-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj L Táblázat X r2 r3 R4 Op (c = 1,50%-os ecetsav) 1. Ac 4-F-D-Phe D-Trp B-D-2NAL-16,1° ± l8 2. Ac 4-F-D-Phe B-D-2NAL D-Trp-69,2° ± 1° 3. Acr 4-F-D-Phe B-D-1NAL D-Trp-83,66° ± 1° -70,3° ± 1° 4. Acr 4-F-D-Phe D-Trp B-D-1NAL 5. Ac 4-F-D-Phe B-D-1NAL B-D-1NAL-72,5° ± 1° 6. Ac 4-F-D-Phe B-D-2NAL B-D-2NAL-85,15° ± 1° 7. Ac 4-F-D-Phe B-D-1NAL B-D-2NAL +81,9° ± 1° 8. Ac 4-F-D-Phe B-D-2NAL B-D-1NAL-73,48° ± 1° 9.* H acetát-só 4-F-D-Phe B-D-2NAL B-D-2NAL-71,23° ± 1° * = A sót úgy állítjuk elő, hogy 30 ml 1 n ecetsavat adunk 50 mg dekapeptid oldatához. Példa gyanánt a fenti, (Ac-Dehidro Pro1, 4-F-D-Phe\ D-Trp , B-D-2NÁL6)-nak nevezett 1. számú peptid szilárd fázisú szintézisét az alábbiakban ismertetjük. E peptid képlete a következő: Ac-Dehidro Pro-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-B-D-2NAL-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. BHA gyantát használunk, és Boc-védett Gly-t kapcsolunk a gyantához metilén-dikloridban (CH2- -Cl2) 2 őrá alatt, a Boc-származékot háromszoros feleslegben alkalmazzuk, és aktivátorként diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használunk. A glicin-rész a BHA-részhez amidkötéssel kapcsolódik. Minden aminosav hozzákapcsolása után mosást, védőcsoportlehasítást és a következő aminosav hozzákapcsolását az alábbi munkamenet szerint hajtjuk végre automatizált készülék segítségével és körülbelül 5 g gyantából kiindulva: Keverési idők Lépés _____Reagensek és műveletek______(perc) 1CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 2 Metanol (MeOH) mosás — 30 ml (kétszer) 3 3 CH2CL2 mosás - 80 ml (háromszor) 3 4 50% trietanol-amin (TEA) + 5% 1,2-etán-ditiol CH2C12-ben 70 ml (kétszer) 10 5 CH2C12 mosás — 80 ml (kétszer) 3 612,5% TEA CH2CH2-ben - 70 ml (kétszer) 5 7 MeOH mosás — 40 ml (kétszer) 2 8 CH2C12 mosás - 80 ml (háromszor) 3 9 Boc-anünosav (10 millímól) 30 ml dimetil-formamidban (DMF) vagy CH2Cl2-ben, függően az illető védett aminosav oldhatóságától (egyszer) plusz DCC (10 millimol) CH2Cl2-ben 30-300 10 MeOH mosás — 40 ml (kétszer) 3 11 12,5% TEA CH2Cl2-ben - 70 ml (egyszer) 3 12 MeOH mosás — 30 ml (kétszer) 3 13 CHjC12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 A 13. lépés után alikvotot veszünk ki ninhidrinpróbához: ha a próba negatív visszatérünk az 1. lépéshez a következő aminosav kapcsolása céljából. ha a próba pozitív vagy enyhén pozitív, megismételjük a 9—13. lépést. A találmány szerinti peptid minden egyes aminosavának kapcsolásához a fenti munkamenetet alkalmazzuk, miután az első aminosavat a hordozóhoz kapcsoltuk. NoBoc-védelmet alkalmazunk a fennmaradó összes aminosavhoz a szintézis folyamán. NoßocB-D-NAL-t ismert módszerrel állítunk elő, például a 4,234,571 számú, 1980. november 18-án közzétett Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban részletesen leírtak szerint. Az Arg oldalláncot Tos csoporttal védjük meg. Oldalláncvédő csoportként OBzl csoportot használunk a Ser hidroxilcsoportjához, és 2,6-dikiór-benzil-csoportot alkalmazunk oldalláncvédő csoportként a Tyr hidroxilcsoportjához. Végső aminosavként N-acetil-dehidro-Pro-t építünk be. A CH2Cl2-ben rosszul oldódó Boc-Arg(Tos) és Boc-D-Trp kapsolását DMF/CH2 Cl2 keverékben hajtjuk végre. A peptid lehasítása a gyantáról és az oldalláncok teljes védőcsoportmentesítése igen könnyen végbemegy 0 C-on HF hatására. Szennyezések eltávolítására szolgáló anyagként anizolt alkalmazunk a HF- kezelés előtt. Miután a HF-ot vákuumban eltávolítottuk, a gyantát 50%-os ecetsawal extraháljuk és a mosófolyadékokat liofilizálva nyers peptidport kapunk. A pepiidet ezután ioncserélő kromatográflával tisztítjuk CMC-oszlopon (Whatman CM 32), az oszlopot 50 : 50 arányú metanol/víz eleggyel készült 0,05—0,3 mólos ammonium-a cet át gradienssel eluáljuk, majd megoszlásos kroinatográfiát végzünk célszűrő oszlopon, n-butanol/0,1 n ecetsav 1 : 1 térfogatarányú eluens rendszert használva. A peptid rétegkromatográfiával homogénnek bizonyul számos különböző oldószerrendszert használva. Hasonló eredményt kapunk fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, vizes trietil-ammónium-foszfátot és acetonitrilt használva. A kapott tisztított peptid aminosavanalizise megfelel az 25 30 35 40 45 50 55 60 4
