186007. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormon antagonista peptidek előállítására
1 2 Minthogy ezek a dekappeptidek igen hatásosan gátolják az LH-felszabadulást, gyakran GnRH-antagonistáknak nevezik őket. E peptidek nőstény emlősöknél gátolják az ovulációt, ha igen alacsony dózisszinten a proösztruszban (ivarzás előtti ciklusban) alkalmazzuk őket, és hatásosan hozzák létre a megtermékenyített peték reszorpciójátis röviddel a fogamzás után alkalmazva. E peptidek hím emlősök kontraceptív kezelésére is használhatók. Közelebbről meghatározva, a találmány szerinti peptidek a következő általános képlettel ábrázolnatók: X-R, -R2 -R3 -Ser-Tyr-R4-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (I), ahol X hidrogénatomot, 14 szénatomos alkanoil- vagy 2:5 szénatomos alkenoilcsoportot jelent, Rí jelentése dehidro-Pro, R2 jelentése F-D-Phe és R3 és R4 jelentése D-Trp vagy B-D-NAL, azzal a kikötéssel, hogy vagy R3 vagy R4 B-D-NAL-t jelent, X1 olyan típusú cr-amino-védőcsoport, hrelynek hasznossága jól ismert peptidek lépésenként! szintézisénél és, ha az előállítani kívánt pepiidben X acilcsoportot jelent, úgy az a csoport használható védőcsoport gyanánt. Az X1 jelentésének megfelelő a-amino-védőcsoportok osztályaiba tartoznak (1) acil-típusú védőcsoportok, mint a formilcsoport, (For), trifluor-acetil-, ftalil-, p-toluolszulfonil-, (Tos). benzoil- (BZ), benzolszulfonil-, o-nitro-fenil-szulfenil-, 0-nitro-fenoxi-acetil-, akrilil- (Acr), klór-acetil-, acetil- (Ac) és -klór-butiril-csoport, (2) aromás uretán-típusű védőcsoportok, például benzil-oxi-karbonil- (Z) és szubsztituált benzil-oxi-karbonil-, mint p-klór-benzil-oxo-karbonil-, p-nitro-benzil-oxi-karbonil-, p-bróm-benzil-oxi-karbonil- és p-metoxi-benzÜ-oxi-karbonil-csoport, (3) alifás uretán-típusű védőcsoportok, mint terc-butil-oxi-karbonil- (Boc), diizopropil-metoxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, és allil-oxi-karbonil-csoport, (4) cikloaíifás uretán-típusú védőcsoportok, mint ciklopentil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil- és ciklohexil-oxi-karbonil-csoport, (5) ti ouretán-típusú védőcsoportok, mint fenil-tio-karbonfl-csoport, (6) alkil-típusú védőcsoportok, mint allil- (Aly), trifenil-metil- (tritil) és benzilcsoport (Bzl), (7) trialkil-szilán-csoportok, mint trimetil-szilán. Előnyös ctamino-védőcsoport a Boc, ha X hidrogénatomot jelent. X3 a Ser alkoholos hidroxilcsoportjának védőcsoportja, és jelentése aceitl-, benzoil-, tetrahidropiranil-, terc-butil-, tritil-, benzil- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport. Előnyben részesítjük a benzilcsoportot. X3 a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának védőcsoportja és jelentése tetrehidropiranil-, terc-butil-, tritil-, benzil-, benzil-oxi-karbonil-, 4-bróm-benzil-oxi-karbonil- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport. Előnyben részesítjük a diklór-benzil-csoportot. X4 az Arg nitrogénatomjának védőcsoportja és jelentése nitro-, Tox, benzil-oxl-karbonfl-, adamentil-oxi-karbonil-csoport vagy Boc, X4 azonban hidrogénatom is lehet, ami azt jelenti, hogy nincsenek védőcsoportok az Arg oldalláncbeli nitrogénatomjain. Előnyben részesítjük a Tos csoportot. Az X3—X4 oldallánc-védőcsoportok kiválasztásának kritériuma, hogy a védőcsoport stabil legyen a reagenssel szemben annak a reakciónak a körülményei között, melyet a szintézis minden lépésénél az O-amino-csoport eltávolítására alkalmazunk. A védőcsoportnak nem szabad lehasadnia a kapcsolás körülményei között, és eltávolíthatónak kell lennie a kívánt aminosav-szekvencia szintézisének befejezése után, a peptidláncot nem befolyásoló reakciókörülmények között. Az N-terminális aminocsoport szilárd fázisú szintézis esetén a peptidkémiában önmagában ismert gyantahordozóhoz kapcsolódik. Ha X acetil-, formil-, akrilil- vagy valamely más, fent definiált acilcsoportot jelent, akkor X úgy használható, mint az X! védőcsoport az Rt aminosav a-arninocsoportjához, és ebben az esetben az utolsó aminosavnak a peptidlánchoz való kapcsolása előtt alkalmazhatjuk. Azonban úgy is eljárhatunk, hogy a reakciót a gyantán lévő pepiiddel hajtjuk végre, például ecetsavval reagáltatjuk diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében, vagy előnyösen ecetsavanhidriddel. A teljesen megvédett peptid a klórmetilezett gyantahordozóról ismert módon ammonolízissel hasítható le és így teljesen megvédett amid közbenső terméket kapunk. A peptid védőcsoportjainak eltávolítását, valamint a peptid lehasítását a benzhidril-amin gyantáról 0°C-on hi drogén-fluorid (HF) segítségével hajtjuk végre. A HF-os kezelés előtt előnyösen anizolt adunk a pepiidhez. A HF vákuumban való eltávolítása után a lehasított, védőcsoportmentesített pepiidet célszerűen éterrel kezeljük, dekantáljuk, híg ecetsavban felvesszük és liofilizáljuk. A peptid tisztítása ioncserélő kromatográfiával történik karboxi-metil-cellulóz (CMC) oszlopon, majd megoszlásos kromatografálást végzünk Sephadex G-25 oszlopon n-butanol — 0,1 n ecetsav (1 : 1 térfogatarány) eluenst használva, vagy ismert módon nagynyomású folyadékkromatográfíát (HPLC) alkalmazunk. A találmány szerinti peptidek 200 jug/testsúlykg-nál alacsonyabb dózisszinteken gátolják nőstény patkányok ovulációját, ha déltájban a proösztrusz napján alkalmazzuk őket. Az ovuláció tartós visszaszorítása céljából körülbelül 0,1—5 mg/testsúly-kg dózisszintek alkalmazása szükséges. A találmány szerinti antagonisták hatásos fogamzásgátlók is, ha szabályos ütemben hím emlősöknél alkalmazzuk őket. Mivel e vegyületek csökkentik a tesztoszteronszintet (nem kívánatos következmény normális, szexuálisan aktív hímeknél), célszerű lehet tesztoszteron utánpótlási dózisokat alkalmazni a GnRH-antagonistával együtt. Ezen antagonisták más célokra is használhatók gonadotroplnok és nemi hormomonok szabályozására, mint fentebb említettük. A következő példa a találmány további jellegzetességeit ismerteti, anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátozná. 186 007 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
