185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
1 185668 2 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban, 20 percig, meglepő módon majdnem tiszta emberi inzulint kapunk. A kísérletet az alábbiak szerint végezzük: Az átalakult inzulint az enzimtől és az alacsony molekulasúlyú anyagoktól SephadexR G—50-en végzett kromatográfiával elválasztjuk, majd az anyagot DEAE-SephadexR A—25 oszlopon kromatografáljuk, a 3. ábránál leírt eljárást alkalmazva. AII. csúcsban eluálódik, mint az várható, a reakciótermék, míg az átalakulatlan inzulin (<10%) az I. csúcsban eluálódik. Nem kapunk III. csúcsot, vagyis nem keletkeznek lizint nem tartalmazó inzulin-származékok. Mint a 2. táblázat adataiból látható, CPD—A-val, CPD—Y-nal és tripszinnel végzett emésztések eredményeként csak a treonin tartalom változik jelentősen. Ez az eredmény összhangban van azzal, hogy az alkalmazott pH-n a CPD—Y nem rendelkezik peptidáz aktivitással. II. táblázat A 3. ábra szerinti I., IL, III. csúcs és az I. csúcs frakcióinak dezamidálásával kapott II. csúcs aminosav-összetétele Aminosav I. csúcs II. csúcs III. csúcs I. csúcs dezamidálása után kapott II. csúcs Aszparaginsav 2,99 2, 99 3,01 3,01 Treonin 3,62 2,52 2,50 2,79 Szerin 2,93 2,92 2,92 2,93 Glutaminsav 6,88 7,16 7,18 7,01 Prolin 1,00 0,98 0,71 0,87 Glicin 4,00 4,00 4,00 4,00 Alanin 1,16 1,52 1,03 1,09 Valin 2,42 2,82 2,81 2,50 izoleucin 0,94 1,04 1,09 1,19 Leucin 5,80 6,21 6,18 6,10 Tirozin 3,80 3,86 3,67 4,02 Fenilalanin 2,74 2,82 2,65 2,64 Hisztidin 1,96 1,90 1,93 1,89 Lizin 0,99 0,74 0,06 1,01 Arginin 0,96 1,00 0,98 0,89 A dezamidálás után kapott II. csúcs aminosavösszetétele közel azonos az emberi inzulin analízisénél kapott eredményekkel: Thr —2,87, Alá—1,05, Lys — 0,98. A dezamidált termék CPD—Y-nal, CPD—A-val és tripszinnel végzett emésztése azt jelzi, hogy a minta 90—95%-ban tiszta emberi inzulint tartalmaz. Ebből arra következtethetünk, hogy a Pro- Lys-Thr-Thr-NH2 inzulin-származék majdnem kizárólag az enzim peptidil-aminosav-amid-hidroláz aktivitása útján, míg a -Pro-Lys-Thr-NH2 majdnem kizárólag az amidázaktivitás útján lép reakcióba. A sertés inzulin emberi inzulinná alakulásának teljes kitermelése körülbelül 30%, az átalakult inzulinra vonatkoztatva. 5. példa A (B—30-dezalanin)-sertés inzulin (DAI) és a treonin-amid tripszin-katalizálta kondenzációjával kapott emberi inzulin-amid dezamidálását mutatjuk be ebben a példában. Annak bizonyitására, hogy az inzulin-amidok előnyös CPD—Y-katalizálta dezamidálása nem korlátozódik a találmány szerinti transzpeptidációs eljárással kapott inzulin-amidokra, Morihara és munkatársai [EP 17 938. számú európai szabadalmi leírás és Biochem. Biophys. Res. Comm. 92, 396 (1980), valamint Nature 280, 412 (1979)] módszere szerint is előállítottunk emberi inzulint. Megjegyezzük, hogy az EP 17 938. számú szabadalmi leírásban az aminokat treonin karboxilcsoportjának egyik lehetséges védőcsoportjaként megemlítették ugyan, de alkalmazhatóságát rém támasztották alá példákkal, az egyetlen példában a treonin-terc-butil-észterrel foglalkoztak. A reakciót a következő reakcióvázlattal szemléltetjük: _ . Tripszin-Thr-NH2 DAI ----------TT7~e-------■>pH 6,5 CPD—Y DAI-Thr-NH2 —-------—► DAI-Thr---------------> DAI Ennek az eljárásnak jelentős előnye az EP 17938. számú szabadalmi leírásban szereplő módszerrel szemben az, hogy az enzimes dezamidálás sokkal enyhébb körülmények között megy végbe, mint a Morihara és munkatársai által alkalmazott sav-katalizálta dezészterezés. A DAI-Thr-NH2 előállítása 400 mg treonin-amid-hidrokloridot 2 ml 60%-os dimetil formamidban szuszpendálunk. A pH-t 6,5-re állítjuk 20 pl piridinnel és 50 pl 6 mól/1 NaOH-dal, majd 100 mg tripszint és 100 mg DAI-t adunk a szuszpenzióhoz, 0,5 óra elteltével a reakciót 1 ml hangyasav hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet SephadexR G—50 oszlopon 1 mól/1 ecetsavval frakcionáljuk. A következő frakciókat kapjuk: Trips zin frakció 60 mg Inzuhn frakció 102 mg Maradék 371 mg A ’02 mg inzulin frakciót ioncserélős kromatográfiás módszerrel tisztítjuk 7 mól/1 karbamiddal ekvilibrál DEAE-SephadexR A—25 oszlopon NaCl gradienssel eluálva, az EP 17938. számú szabadalmi leírás szerint. 59,2 mg tiszta emberi inzulin-amidot (DAI-Thr- NH2) kapunk, melyet aminosav-analízissel mutatunk ki. DAI-Thr (emberi inzulin) előállítása 11 mg DAI-Thr-NH2-t 2 ml 1 mmól/1 EDTA-t és 2 mmói/1 KCl-ot tartalmazó oldatban oldunk. A pH-t 9,0-ra állítjuk 51 pl 0,5 mól/1 NaOH-dal, majd 50 pl, 13,6 mg/ml koncentrációjú CPD—Y-t adunk az oldathoz. 15 perc elteltével a reakciót 25 pl 6 mól/1 HC1 hozzáadásával a pH-t 1,2-re csökkentve leállítjuk. A reakc'óelegyet SephadexR G—50 oszlopon 1 M ecetsavval eluálva választjuk el. 8 mg emberi inzulint kapunk Az aminosav-analízis eredménye a III. táblázatban látható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
