185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
185 668 III. táblázat Aminosav-analizis , . Emberi inzulin Aminosav „ , , . (képlet) DAI Amid Emberi inzulin Aszparaginsav 3 2,97 3,05 3,04 Treonin 3 1,91 2,94 2,90 Szerin 3 2,86 2,86 2,95 Glutaminsav 7 7,27 7,23 7,04 Prolin 1 0,94 0,95 0,85 Glicin 4 4,000 4,000 4,030 Alanin 1 1,00 1,00 1,04 Cisztein 6 5,31 5,19 5,02 Valin 4 3,37 3,11 3,24 Izoleucin 2 1,36 1,22 1,40 Leucin 6 6,28 6,20 6,13 Tirozin 4 3,64 3,97 3,7 Fenilalanin 3 2,82 2,92 2,8 ‘ Hisztidin 2 1,96 1,96 1,8” Lizin 1 0,94 1,00 0,95 NH3 6 8,12 6,46 6,98 Arginin í 0,98 0,99 0,8" Thr/Ser 1,00 1,003 1,027 0,984 ( x 3/2) 6. példa Cinktartalmú sertés inzulin 7 mg/ml-es, 1,0 mól/1- es treonin-amiddai készült oldatához (pH 6,5) 0,43 mg/ml végkoneentrációban Pénicillium janthinellumból származó karboxipeptidáz P-t (CPD—P) adunk, és a reakcióelegyet 25 °C-on 2,5 órán át inkubáljuk. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a sertés inzulin 50%-a emberi inzulinná alakul a fenti idő alatt. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás inzulinok B—30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére, azzal jellemezve, hogy a kívánt Inz—X általános képletű inzulin szubsztráte t — a képletben X egy B—30 aminosavaí jelent — eg ; a) H-B-NH2 általános képletű aminosav-amíddd — a képletben B aminosav-maradékot jelent — vagy p) H-B-OR3 általános képletű arainosav-észterrel — a képletben B aminosav-maradékot jelent, R3 jelentése alkil-, cikloalkil-, arií-, heteroaril-vagv aralkilcsoport — reagáltatunk egy L-specifikus szerin- vagy tiol-kar boxipeptidáz enzim jelenlétében, 7—10,5 pH-értéken vizes oldatban vagy diszperzióban, majd a kapott ínz B-NH2, Inz-B-B-NH2 vagy Inz-B-OR3 általános képle tű inzulin-származékokról — a képletben a szubszti tuensek jelentése a fenti — az -NH2, -B-NH2 vagy -OR3 védőcsoportokat eltávolítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás módja, azzal jellemezve, hogy az -NH2s -B-NH2 vagy —OR3 általános képletű csoportok — a képletekben B és R3 jelentése az 1. igénypont szerinti — eltávolítására egy karboxipeptidáz enzimet használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás^ módja, azzal jellemezve, hogy pH 9,0 értéken amidáz aktivitást mutató karboxipeptidáz enzimet használunk. 4. Az 1, igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy pH 4—9 értéken peptídáz aktivitást mutató karboxipeptidáz enzimet használunk. 5. Az 1, igénypont szerinti eljárás foganatosítási ! módja, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként élesztőből származó karboxipeptidáz Y-t használunk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy műgyanta hordozóból 1 és az ahhoz kapcsolt benzil-szukcinil-csoportokból álló gyantán végzett affinitás! kromatográfiás módszerre! tisztított karboxipeptidáz Y enzimet használunk. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz env> zimként Pénicillium janthinellumból származó penicillokarboxipeptidáz S—1-et vagy S—2-t használunk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az oldat vagy diszperzió pH-ját 7,5—10,5 értéken tartjuk. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 7,5—10,5 pH-n hajtjuk végre, vagy pH 7,5—10,5 tartományon belül egy kívánt pH-értéken, melyet a vizes oldathoz a reakcióelegyben mért pH-értéknek megfelelően sav il! vagy lúg hozzáadásával állandó értéken tartunk. 10. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0—50 térfogat% szerves oldószert tartalmazó vizes oldatban vagy diszperzióban hajtjuk végre a reakciót. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként dimetil-formamidot használunk. 12. Az 1—10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0—3 mól/l karbamidot vagy guanidin-hidiokloridot tartalmazó vizes oldatot vagy diszperziót használunk. 13. Az Η12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakció lefolytatásához 0,002—0,5 mól/l inzulin szubsztráí és 0,05—3 mól/l amin-komponens kiindulási koncentrációkat használunk. 14. Az 1—13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakció lefolytatásához 10"4—10~4 mól/l karboxipepti■ dáz enzim koncentrációt használunk. 15. Az 1—14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szubsztrát-komponensként sertés inzulint, amin-komponensként treonin-amidot használunk. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az Inz-B-NH2, Inz-BB-MH2 vagy Inz-B-GR3 általános képletű inzulin-származékokról — a képletekben B és R3 jelentése az 1. igénypont szerinti — a védőcsoportok lehasííására a ,s származékokat valamely L-specifikus szerin- vagy tioi-karboxipeptidáz enzimmel 7—10,5 pH-jú vizes oldatban vagy diszperzióban kezdjük. 4 ib ábra 10
